一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，公开了一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、及其构建方法和试剂盒。构建方法包括步骤：1)获得DNA样本；2)利用引物组的引物对所述DNA样本进行第1轮多重PCR扩增，得到扩增产物；3)合并第1轮多重PCR反应得到的扩增产物，在扩增产物中加入接头引物1和接头引物2，然后进行第2轮接头序列PCR反应，得到基因检测文库。本发明专利技术构建方法基因panel扩大，检测范围更加全面，测序覆盖度达到100％；构建的基因检测文库适用于DNBSEQ测序平台。测序平台。测序平台。

【技术实现步骤摘要】
一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)是一种常染色体显性遗传病，病理特征为血浆总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL
‑
C)水平增高及早发冠心病(PCAD)。冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)的病理基础是动脉粥样硬化(AS)，而FH因血脂代谢异常会间接或直接促发AS，与PCAD(CAD发病年龄男性＜55岁，女性＜65岁)的发生、发展具有密切关系。FH患者血脂代谢失衡会加快AS及PCAD进程，早期发现和诊断FH，及早进行干预，可显著降低冠脉疾病的发病率及死亡率，改善临床预后。
[0003]目前已知的FH相关变异超过2000个，其中约1000个变异已经得到足够证据支持而被归类为致病变异和可能致病变异两类之中，这些变异主要分布在三个基因：LDLR(90％以上)、APOB(5％～10％)和PCSK9(1％以下)。但是，随着基因测序技术的发展，以及医患对于FH认知的不断提高，越来越多的基因，以及基因的突变位点被发现，对FH的相关基因检测的覆盖度还有待于进一步改善，例如授权公告号为CN109517884B的中国专利技术专利公开了FH的测序文库，仅涉及LDLR、APOB、PCSK9这三种基因，覆盖度有待于进一步提高，并且采用的是Ion Torrent测序平台。
>[0004]与目前非常成熟，并且已经面临要被更新迭代的Ion Torrent测序平台和Illumina测序平台相比，DNBSEQ测序平台主要定位于医院、检验所级别的中小型规模的测序应用场景，仪器成本低，各项性能指标更加优异，但是目前还未见基于DNBSEQ测序平台的FH基因检测文库的相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒，以至少解决上述技术问题之一。
[0006]本专利技术实现其目的采用的技术方案是：
[0007]一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，包含引物组3，引物组3的序列为SEQ ID NO.323
‑
382，检测如下基因或基因位点：LDLRAP1基因，CELSR2基因的多态性位点rs629301，ABCG8基因的多态性位点rs4299376，SLC22A1基因的多态性位点rs1564348，HFE基因的多态性位点rs1800562，MYLIP基因的多态性位点rs3757354，ST3GAL4基因的多态性位点rs11220462，NYNRIN基因的多态性位点rs8017377，APOE基因的多态性位点rs429358、rs7412，LDLR基因的多态性位点rs6511720，APOB基因的多态性位点rs1367117，PCSK9基因的多态性位点rs2479409。
[0008]本专利技术还提供另一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，包含引物组1，引
物组1的序列为SEQ ID NO.1
‑
152，检测如下基因：LDLRAP1基因、LDLR基因，APOB基因，PCSK9基因。
[0009]本专利技术还提供第三种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，包含引物组2，引物组2的序列为SEQ ID NO.153
‑
322，检测如下基因：LDLR基因，APOB基因，PCSK9基因，LDLRAP1基因。
[0010]上述的任意一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，还包括测序接头引物1和接头引物2，所述接头引物1的序列为SEQ ID NO.383所示，所述接头引物2的序列为SEQ ID NO.384所示。
[0011]本专利技术提供的一种家族性高胆固醇血症基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
[0012]1)获得DNA样本；
[0013]2)采用权利要求1所述的试剂盒中的引物组3，权利要求2所述的试剂盒中的引物组1，权利要求3所述的试剂盒中的引物组2中的任一组，任意两组，或三组对所述DNA样本进行第1轮多重PCR反应得到扩增产物；
[0014]3)合并第1轮多重PCR反应得到的扩增产物，在扩增产物中加入接头引物1和接头引物2，然后进行第2轮接头序列PCR反应，得到基因检测文库。
[0015]在上述技术方案中，所述步骤3)中，当引物组1
‑
3分别进行第1轮多重PCR反应时，引物组1
‑
3的多重PCR扩增产物以体积比6
‑
8﹕5
‑
7﹕1
‑
3合并。
[0016]在上述技术方案中，引物组1和引物组2的第1轮多重PCR反应的反应条件如下：
[0017][0018]引物组3的第1轮多重PCR反应的反应条件如下：
[0019][0020]本专利技术提供的一种家族性高胆固醇血症基因检测文库，所述基因检测文库由上述任一项所述的构建方法制备而成。
[0021]本专利技术的有益效果在于：
[0022](1)本专利技术设计了适用DNBSEQ测序平台的关于FH基因检测的191对引物对(SEQ ID NO.1
‑
382)，其中引物SEQ ID NO.1
‑
324，以及引物SEQ ID NO.347
‑
382用于检测LDLRAP1基因、PCSK9基因、LDLR基因和APOB基因的编码外显子及侧翼区(
±
10bp)，主要考虑的是单基因遗传的突变特点，测序覆盖度已经能够达到100％。
[0023](2)除了考虑单基因遗传的突变特点外，本专利技术还考虑到了多基因遗传病的突变特点，将CELSR2基因的多态性位点(rs629301)，ABCG8基因的多态性位点(rs4299376)，SLC22A1基因的多态性位点(rs1564348)，HFE基因的多态性位点(rs1800562)，MYLIP基因的
多态性位点(rs3757354)，ST3GAL4基因的多态性位点(rs11220462)，NYNRIN基因的多态性位点(rs8017377)，APOE基因的多态性位点(rs429358、rs7412)，LDLR基因的多态性位点(rs6511720)，APOB基因的多态性位点(rs1367117)，PCSK9基因的多态性位点(rs2479409)纳入到检测范围，进一步提高了基因检测文库的覆盖范围。
[0024]本专利技术提供的多重靶向捕获试剂盒能够检测FH相关基因变异的多个位点，基因panel扩大，检测范围更加全面，测序覆盖度能够达到100％，不需要使用探针捕获，利用多重PCR扩增实现待测区域的高度覆盖，具有高检测覆盖度和高均一性，样本消耗量少、样本要求低。
[0025](3)三组引物组，主要分组依据在于GC含量，以及防止引物之间相互配对，其中，引物组1和引物组2的GC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，其特征在于：包含引物组3，引物组3的序列为SEQ ID NO.323
‑
382，检测如下基因或基因位点：LDLRAP1基因，CELSR2基因的多态性位点rs629301，ABCG8基因的多态性位点rs4299376，SLC22A1基因的多态性位点rs1564348，HFE基因的多态性位点rs1800562，MYLIP基因的多态性位点rs3757354，ST3GAL4基因的多态性位点rs11220462，NYNRIN基因的多态性位点rs8017377，APOE基因的多态性位点rs429358、rs7412，LDLR基因的多态性位点rs6511720，APOB基因的多态性位点rs1367117，PCSK9基因的多态性位点rs2479409。2.一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，其特征在于：包含引物组1，引物组1的序列为SEQ ID NO.1
‑
152，检测如下基因：LDLRAP1基因、LDLR基因，APOB基因，PCSK9基因。3.一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，其特征在于：包含引物组2，引物组2的序列为SEQ ID NO.153
‑
322，检测如下基因：LDLR基因，APOB基因，PCSK9基因，LDLRAP1基因。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘哲，梁庆渊，赵娜娜，赖开生，刘昕超，高璇，李方玉，侯青，惠汝太，
申请(专利权)人：江苏百世诺医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：