一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒检测罗库溴铵代谢标志物ABCB1 1236C/T的基因多态性，试剂盒针对ABCB1 1236C/T的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、ABCB1 1236C/T测序引物和阳性对照。本发明专利技术采用样本处理液快速样本释放出DNA，样本量为30ul全血，相比一步裂解法和直接扩增(约2

【技术实现步骤摘要】
一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

技术介绍

[0002]罗库溴胺(Rocuronium bromide)是一种甾类非去极化肌肉松弛剂，为季铵盐结构药。它通过竞争性地与运动神经末梢突触上的乙酰胆碱受体结合，从而阻断了乙酰胆碱的结合，抑制了神经肌肉兴奋信息的正常传递而产生肌肉松弛的作用。因其起效迅速，有良好的循环系统稳定性，而在临床中广泛应用。它主要经过肝肾代谢，大部分通过粪便、尿液以原型排出，只有极少部分以活性减弱约20倍的17
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羟罗库溴铵的形式经胆汁排泄。但在实际应用中我，罗库溴铵的代谢存在很大的个体差异，产生这种差异性的因素有很多，包括性别、年龄、体重、身体状态及遗传因素等。
[0003]多重耐药基因(the multidrug resistancegene MDR1 or ABCB1)位于人类7号染色体，有28个外显子，包含3843个碱基对。P
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糖蛋白(P
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gp)是ABCB1编码的产物，P
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gp被证实是一种ATP依赖的跨膜的主动外排泵并有广泛的作用底物，介导外源性物质的排除和多种内源性及外源性物质的转运。罗库溴胺是P
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gp的底物之一，可以将罗库溴胺从肝细胞排泄入胆管内，进而排出体外，研究表明，ABCB1基因的多态性可能会影响P
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gp的功能和活性，从而影响底物的代谢。ABCB1基因编码的p
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糖蛋白在个体表达中存在很大的差异，有研究表明，基因多态性可能是导致这种表达差异的主要因素之一，ABCB1(1236C/T)单体型可能会通过替换密码子来调节翻译的速度和节奏，从而导致p
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糖蛋白发生细微结构的局部性变化，进而影响对各种调节分子和底物的亲和力。ABCB11236C/T位点不同基因型的患者，CC和CT组组的肌松诱导剂量和追加剂量的维持时间均比TT组更短，CC和CT组的肌松恢复时间也比TT组更短。
[0004]目前，基因多态性检测的方法有很多种，主要采用荧光PCR。主要包括高分辨率熔解曲线法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法。高分辨率熔解曲线法步骤简单，但特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增操作方法简单，但检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法试验成本较高。
[0005]目前对血液DNA的获得方式主要有传统的柱式提取、磁珠法提取，此两种方法均耗时较久，操作较为繁琐。CN201610022581.8提出了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应。该专利技术也同样需要对磁珠进行洗涤。因此，急需建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测IRS
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1基因多态性的焦磷酸测序方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：
[0008]所述罗库溴铵疗效预测的基因多态性检测试剂盒针对ABCB1(1236C/T)的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、ABCB1(1236C/T)测序引物、阳性对照。
[0009]具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：
[0010]引物名称SEQ ID序列标记ABCB1(1236C/T)
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F11TGAATTGCCTTGAAGTTTTTTTCTCACTCG5`BiotinABCB1(1236C/T)
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R12GTCATAGAGCCTCTGCATCAGCTGGACTGT ABCB1(1236C/T)
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S13TCTGCACCTTCAGGTT ABCB1(1236C/T)待检序列4CAGRCCCTTCAAGATCTACCAGGACGAGT ABCB1(1236C/T)分配指令5GCTAGACTC [0011]优选的，ABCB1(1236C/T)扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。
[0012]优选的，ABCB1(1236C/T)测序引物如序列表SEQ ID NO:3所示。
[0013]优选的，ABCB1(1236C/T)测序引物对应的测序区域为ABCB1(1236C/T)待检序列，如序列表SEQ ID NO:4所示；优选的，ABCB1(1236C/T)分配指令如序列表SEQ ID NO:5所示。
[0014]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
[0015]优选的，所述样本处理液，不包含胍盐，通过碱性条件和表面活性剂对样本进行裂解。包括0.1％
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0.6％十二烷基硫酸锂、0.1
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0.5％曲拉通X
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100、2
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50mg/mL氢氧化钠、5
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15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20
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80mM Tris
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HCl、100mM NaCl，PH＝8.5
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9.5。
[0016]更优选的，所述样本处理液，包括0.3％
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0.5％十二烷基硫酸锂、0.2
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0.4％曲拉通X
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100、10
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20mg/mL氢氧化钠、8
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12mM甜菜碱、8
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12％海藻糖、4～6mM BSA、50mM Tris
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HCl、100mM NaCl，PH＝9。
[0017]优选的，所述的磁珠为羧基磁珠，粒径为600mm，悬浮性较好，磁性能较强，吸附量大。反应液中磁珠浓度为0.2mg/25μL，血液样本中DNA吸附量为30ng～260ng，完全满足扩增所需的DNA量。
[0018]优选的，所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁。
[0019]优选的，所述的扩增试剂2包括：ABCB1(1236C/T)前引物(0.32uM)，ABCB1(1236C/T)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒检测罗库溴铵代谢标志物ABCB1 1236C/T的基因多态性，试剂盒针对ABCB11236C/T的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、ABCB1 1236C/T测序引物和阳性对照。2.根据权利要求1所述的用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1 1236C/T扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1 1236C/T测序引物如序列表SEQ ID NO:3所示。4.根据权利要求1所述的用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，ABCB1 1236C/T分配指令如序列表SEQ ID NO:5所示。5.根据权利要求1所述的用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括0.1％
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0.6％十二烷基硫酸锂、0.1
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0.5％曲拉通X
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100、2
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50mg/mL氢氧化钠、5
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15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20
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80mM Tris
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HCl、100mM NaCl，PH＝8.5
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9.5。6.根据权利要求1所述的用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙悦，周虹桥，刘丹，
申请(专利权)人：上海普然生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：