一种用于LINE-1甲基化检测的检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于LINE

【技术实现步骤摘要】
一种用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

技术介绍

[0002]心血管疾病是由遗传和环境因素共同作用于人体所致的复杂疾病，发病过程与多基因之间和基因
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环境之间的相互作用等有关。表观遗传机制可能通过激活或沉默相关基因，在肥胖和心脏代谢疾病的病因学中发挥重要作用。科学证据表明，LINE
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1甲基化与身体组成和肥胖相关的疾病有关，包括胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病(CVD)。它也被评估为体重减轻的预测因子。LINE
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1甲基化可评估肥胖、减肥、脂血脂障碍、高血压、胰岛素抵抗、CVD和代谢综合征的关系。
[0003]LINE
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1是一种广泛分布于人基因组中的重复序列核元件，其数量大约有50万个。正常情况下LINE
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1是高度甲基化的，甲基化可有效抑制LINE
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1的转录，限制其转座活性。定量检测LINE
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1的甲基化可作为一个全基因组甲基化程度的参考指标。此外，LINE
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1的甲基化程度也可能在肿瘤的发生过程中发挥着重要的作用。
[0004]目前甲基化检测常用方法有甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS
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HRM)、荧光定量法，基因芯片法等。其中，亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)和基因芯片法，往往存在着操作繁琐，检测周期长，假阳性高等不足之处。甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS
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HRM)，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；甲基化特异性PCR(MSP)进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测位点有限。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测LINE
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1甲基化检测的方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以提取合并转化，RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为基础检测LINE
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1甲基化，获得一种用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0006]重组酶聚合酶扩增(RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白
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DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在二十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒的技术方案如下：
[0008]本专利技术的试剂盒针对LINE
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1启动子的甲基化设计特异性扩增引物和多对测序引物，所述试剂盒包括如下组分：裂解液、蛋白酶K、耐热磁珠、转化液、脱硫试剂、漂洗液、洗脱液、扩增缓冲液、扩增试剂(干粉)、LINE
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1测序引物1、LINE
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1测序引物2、阳性对照。
[0009]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0010]引物名称SEQ ID序列(5
’
～3
’
)修饰LINE
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1前引物1GATTTTTCGAGTTAGGTGTGGGATATAGTTT LINE
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1后引物2CCAATAAAAACAACTGCCATCTACAACTGCC LINE
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1测序引物13TTTTAGGTGAGGTAATGT5｀NH2C6LlNE
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1测序引物24ATTAGGGTGGGAGTGAT5｀NH2C6LlNE
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1侍检序列15TTYGTTTTATTTYGGTTYGYGTA LINE
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1侍检序列26TYGATTTTTTAGGTGYGTTYGTTA LlNE
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1分配指令17ATCGTTGATTCAGTCAGTCGT LlNE
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1分配指令28GTCGATTAGTAGTCAGTCGT [0011]优选的，所述LINE
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1甲基化的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQID NO:2所示；更优选的，所述的扩增引物均为普通扩增引物。
[0012]优选的，所述的LINE
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1测序引物1、LINE
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1测序引物2分别如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。
[0013]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。
[0014]更优选的，所述的测序引物，为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的PNA序列的结合物，该结合物与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定且特异性高于DNA/DNA的捕获，且不受盐离子浓度的影响。可既充当测序引物又作为捕获探针，与扩增的产物结合以后，经过简单洗涤即可直接用于测序反应。
[0015]更优选的，所述的测序引物，其制备过程包括将合成氨基标记的测序引物在结合液的情况下与羧基修饰素琼脂糖凝胶微颗粒混合，洗涤去除游离的测序引物，在保存液中2
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8℃保存，该方法可得到中性的肽核酸，无多肽核酸与带负电的DNA之间的静电斥力。
[0016]优选的，LINE
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1测序引物1对应的测序区域为LINE
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1待检序列1，如序列表SEQ ID NO:5所示；LINE
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1测序引物2对应的测序区域为LINE
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1待检序列2，如序列表SEQ ID NO:6所示。
[0017]优选的，LINE
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1待检序列1对应LINE
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1分配指令1如序列表SEQ ID NO:7所示；LINE
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1待检序列2对应LINE
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1分配指令2如序列表SEQ ID NO:8所示。
[0018]优选的，所述的扩增缓冲液包括：扩增缓冲液，18mM醋酸镁。
[0019]优选的，所述的LINE
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1甲基化扩增试剂包括：LINE
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1前引物，LINE
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1后引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒针对LINE
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1启动子的甲基化设计特异性扩增引物和多对测序引物，所述包括如下组分：裂解液、蛋白酶K、耐热磁珠、转化液、脱硫试剂、漂洗液、洗脱液、扩增缓冲液、LINE
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1扩增试剂和阳性对照。2.根据权利要求1所述的用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒，其特征在于，所述LINE
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1甲基化的特异性扩增引物组包括前引物和后引物，引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒，其特征在于，所述多对测序引物包括LINE
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1测序引物1和LINE
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1测序引物2，LINE
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1测序引物1、LINE
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1测序引物2分别如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。4.根据权利要求3所述的用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒，其特征在于，所述LINE
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1测序引物1对应的测序区域为LINE
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1待检序列1，如序列表SEQ ID NO:5所示；LINE
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1测序引物2对应的测序区域为LINE
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1待检序列2，如序列表SEQ ID NO:6所示。5.根据权利要求4所述的用于LINE
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1甲基化检测的检测试剂盒，其特征在于，所述LINE
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1待检序列1对应LINE
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1分配指令1如序列表SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：周虹桥，孙悦，刘丹，
申请(专利权)人：上海普然生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：