一种检测核苷酸大片段缺失的方法和试剂盒技术

本申请提供了一种检测核苷酸片段缺失(特别是大片段缺失)的方法，所述方法通过同时不对称扩增样品中存在的多种靶核酸，能够同时检测一种或多种(例如1、2、5、10、15、19、20、25、30、35、40或更多种)核苷酸片段缺失在靶核酸中的存在。此外，本申请还提供了一种试剂盒，其能够在一轮反应中同时检测一种或多种(例如1、2、5、10、15、19、20、25、30、35、40或更多种)核苷酸片段缺失在核酸分子中的存在。段缺失在核酸分子中的存在。段缺失在核酸分子中的存在。

【技术实现步骤摘要】
一种检测核苷酸大片段缺失的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及核酸分子的多重不对称检测。特别地，本申请提供了一种检测核苷酸片段缺失(特别是大片段缺失)的方法，所述方法通过同时不对称扩增样品中存在的多种靶核酸，能够同时检测一种或多种(例如1、2、5、10、15、19、20、25、30、35、40或更多种)核苷酸片段缺失在靶核酸中的存在。此外，本申请还提供了一种试剂盒，其能够在一轮反应中同时检测一种或多种(例如1、2、5、10、15、19、20、25、30、35、40或更多种)核苷酸片段缺失在核酸分子中的存在。

技术介绍

[0002]基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异(Copy number variation，CNV)。随着CNV微阵列芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，已发现拷贝数变异(CNV)广泛地存在于人类染色体基因组中。CNV主要由基因组重组导致，一般指长度为几kb
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几Mb的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入。目前CNV的检测方法主要有：多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测n种核苷酸片段缺失在样品中的靶核酸中的存在的方法，其中，n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：(a)针对待检测的每一种核苷酸片段缺失，提供通用引物，以及，第一靶特异性引物对和第二靶特异性引物对；其中，所述通用引物包含第一通用序列；第一靶特异性引物对能够扩增野生型靶核酸，并且包含一个正向引物1和一个反向引物1，其中，所述正向引物1包含第二通用序列和特异于所述野生型靶核酸的野生型正向核苷酸序列，且所述野生型正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物1包含第一通用序列和特异于所述野生型靶核酸的野生型反向核苷酸序列，且所述野生型反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；第二靶特异性引物对能够扩增缺失型靶核酸，并且包含一个正向引物2和一个反向引物2，其中，所述正向引物2包含第二通用序列和特异于所述缺失型靶核酸的缺失型正向核苷酸序列，且所述缺失型正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物2包含第一通用序列和特异于所述缺失型靶核酸的缺失型反向核苷酸序列，且所述缺失型反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与所述正向引物1或正向引物2的互补序列完全互补；(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述通用引物以及所述第一靶特异性引物对和第二靶特异性引物对，通过PCR反应扩增样品中的靶核酸；(c)对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定每一种缺失型靶核酸和/或野生型靶核酸是否存在于所述样品中，并确定每一种核苷酸片段缺失是否存在于所述样品中的靶核酸中。2.权利要求1的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述方法用于检测1
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5个，5
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10个，10
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15个，15
‑
20个，20
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50个或更多个靶核酸；(2)在所述方法的步骤(a)中，提供1
‑
5个，5
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10个，10
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15个，15
‑
20个，20
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50个或更多个第一靶特异性引物对和/或第二靶特异性引物对；(3)在所述方法的步骤(b)中，所述通用引物的工作浓度高于所述正向引物1、正向引物2、反向引物1和反向引物2的工作浓度；例如，所述通用引物的工作浓度比所述正向引物1、正向引物2、反向引物1和反向引物2的工作浓度高1
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5倍，5
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10倍，10
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15倍，15
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20倍，20
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50倍或更多倍；(4)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物1、正向引物2、反向引物1和反向引物2的工作浓度是相同的或者各自不同的；(5)所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；(6)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热
稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶；(7)所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失；优选地，所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失；优选地，所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失；优选地，所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del，或其任何组合；(8)在步骤(a)中，当与野生型靶核酸杂交时，所述反向引物1距离所述正向引物1不超过500bp，例如，为200
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500bp；和/或，当与野生型靶核酸杂交时，所述反向引物2距离所述正向引物1和/或正向引物2至少500bp，例如，至少600bp，至少700bp，至少800bp，至少900bp，至少1000bp或更远。3.权利要求1或2的方法，其中，所述方法具有选自下列的任意一个技术特征：(1)在步骤(a)中，当与野生型靶核酸杂交时，所述反向引物1杂交于怀疑发生缺失的核苷酸片段中，且所述正向引物1杂交于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游；所述反向引物2与所述反向引物1不同，并且，所述正向引物1与正向引物2可以相同或不同；(2)在步骤(a)中，当与野生型靶核酸杂交时，所述正向引物1杂交于怀疑发生缺失的核苷酸片段中，且所述反向引物1杂交于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游；所述正向引物1与所述正向引物2不同，并且，所述反向引物1与反向引物2可以相同或不同；(3)在步骤(a)中，当与野生型靶核酸杂交时，所述正向引物1和反向引物1均杂交于怀疑发生缺失的核苷酸片段中；所述反向引物2与反向引物1不同，并且，所述正向引物1与正向引物2不同；并且，当与缺失型靶核酸序列杂交时，所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸互补的序列可以包含断点或位于断点的上游或下游。4.权利要求1
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3任一项的方法，在步骤(a)中，针对每一种核苷酸片段缺失，还分别提供一个野生型检测探针和一个缺失型检测探针，其中，所述野生型检测探针包含特异于所述野生型靶核酸的野生型靶向序列，并且所述野生型靶向序列能够与所述野生型靶核酸中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分区域退火或杂交；所述缺失型检测探针包含特异于所述缺失型靶核酸的缺失型靶向序列，且所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列；优选地，所述方法具有以下任意一种特征：(I)所述缺失型检测探针能够与所述正向引物1和反向引物1扩增野生型靶核酸的产物退火或杂交，且所述野生型检测探针能与所述正向引物2和反向引物2扩增缺失型靶核酸的
产物退火或杂交；优选地，所述野生型检测探针与缺失型检测探针相同；更优选地，所述检测探针的靶向序列全部杂交于野生型靶核酸，且所述检测探针的靶向序列部分杂交于缺失型靶核酸；进一步优选地，所述检测探针与野生型靶核酸杂交时，同时杂交于野生型靶核酸中怀疑发生缺失的核苷酸片段的部分以及不会发生缺失的核苷酸片段的部分，并且，所述检测探针与缺失型靶核酸杂交时，杂交于缺失型靶核酸的断点上游或下游；(II)所述缺失型检测探针能够与野生型靶核酸杂交，并且其杂交位置不位于所述正向引物1的杂交位置与反向引物1的杂交位置之间；并且，所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、第一靶特异性引物对和第二靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将缺失型检测探针和野生型检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、第一靶特异性引物对、第二靶特异性引物对、缺失型检测探针、野生型检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；(2)所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；(3)所述野生型检测探针和缺失型检测探针的长度各自独立地为15
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1000nt，例如15
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
‑
50nt，50
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60nt，60
‑
70nt，70
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80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
200nt，200
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300nt，300
‑
400nt，400
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500nt，500
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600nt，600
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700nt，700
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800nt，800
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900nt，900
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1000nt；(4)所述野生型检测探针和缺失型检测探针中的靶向序列的长度各自独立地为10
‑
500nt，例如10
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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150nt，150
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200nt，200
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250nt，250
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300nt，300
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350nt，350
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400nt，400
‑
450nt，450
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500nt；(5)所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针各自独立地具有3'
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OH末端；或者，所述检测探针的3'
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末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'
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OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端；(6)所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在
其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10
‑
80nt或更长的距离；(7)所述野生型检测探针和缺失型检测探针中的报告基团各自独立地为荧光基团(例如，ALEX
‑
350,FAM,VIC,TET,CAL Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ
‑
1或者BHQ
‑
2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；(8)所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针无抵抗核酸酶活性，或者各自独立地具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'
‑
O
‑
氨基丙基修饰，2'
‑
O
‑
烷基修饰，2'
‑
O
‑
烯丙基修饰，2'
‑
O
‑
丁基修饰，和1
‑
(4'
‑
硫代
‑
PD
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呋喃核糖基)修饰；(9)所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；(10)所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述缺失型检测探针和所述野生型检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；(11)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；(12)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定对应于该熔解峰(熔点)的缺失型靶核酸和/或野生型靶核酸的存在；(13)在步骤(a)中，提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种所述缺失型检测探针和/或野生型检测探针。(14)所述缺失型检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个的组合)：SEQ ID NO:6，11，16，21，26，31，36，41，47和52；(15)所述野生型检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个的组合)：SEQ ID NO:5，10，15，20，25，30，35，40，46和51。5.权利要求1
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4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个特征：(1)所述样品包含或是DNA、或RNA、或核酸的混合物；(2)所述缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是DNA或RNA；(3)所述缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是单链的或双链的。6.权利要求1
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5任一项所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特
征：(1)所述通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1
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5个，5
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10个，10
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15个，15
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20个或更多个核苷酸；(2)所述第一通用序列位于或构成所述通用引物的3'部分；(3)所述通用引物的长度为5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秋英，李庆阁，刘雪铖，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：