本发明专利技术公开了一种多重荧光PCR检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法，所述引物和探针组合物包括EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针和内控系统，其序列如SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 44所示。本发明专利技术在3个反应管内可同时检测EGFR基因32种突变，检测灵敏度为1％，操作简单，节约成本，样本量要求低，临床应用范围广。本发明专利技术可检测新鲜组织样本，FFPE样本及胸腹水样本。样本。
【技术实现步骤摘要】
一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法
[0001]本专利技术属于EGFR基因突变检测
，具体涉及一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法。
技术介绍
[0002]肺癌是目前世界上第一大癌，肺癌的发生率和死亡率在所有肿瘤中都占首位。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占80
‑
85％，目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)临床治疗的重要手段。EGFR是一种跨膜受体络氨酸激酶，该区域的激活即磷酸化对癌细胞增殖、生长的相关信号传递具有重要意义，因此，EGFR作为NSCLC的分子靶标受到普遍关注，并陆续开发出了吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)和埃克替尼(icotinib)等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，多项临床试验已证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从EGFR
‑
TKIs显著获益。EGFR基因突变多位于外显子18
‑
21上。目前已经发现至少30种突变与EGFR
‑
TKIs药物反应性有关，主要是19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变，二者约占所有突变的80
‑
90％，18外显子G719X约占突变的5％，20外显子插入突变约占1％。此外，大部分患者在服用EGFR
‑
TKI一段时间后会出现耐药，其中约50％耐药患者可检测到EGFR 20外显子T790M突变。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC患者临床用药具有重要的参考价值。
[0003]ARMS
‑
PCR(Amplification Refractory Mutation System)技术是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。基本原理：TaqDNA聚合酶缺少3
‑
5外切酶活性，在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变和野生型基因的目的。ARMS
‑
PCR方法灵敏度可达1％，可满足肿瘤组织样本的检测需求。
[0004]目前市面上的EGFR检测试剂盒多为单荧光突变检测，共7个孔，对样本量的要求比较高，成本也较大；厦门艾德生物医药科技股份有限公司的肺癌多基因检测试剂盒中EGFR突变检测采用3个荧光，共4个孔。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术目的是提供一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物、试剂盒和检测方法。所述试剂盒采用4个荧光，3个孔即可实现对EGFR突变的检测。本专利技术可以解决微量样本的检测，提高检测合格率。同时方便了操作，提高了检测通量，降低了成本。
[0006]技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物，所述组合物包括19del、S768I、L858R、EGFR 20ins、T790M、L861Q、G719X及内控的引物和探针，上述引物和探针分为组1、组2和组3，如下表1所示：
[0008]表1 EGFR基因突变引物和探针及分配方式
[0009][0010]。
[0011]一种多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物和探针组合物。
[0012]优选的，所述试剂盒包含：
[0013]NEB universal probe qPCR master mix、上述引物和探针组合物、阳性对照和阴性对照。
[0014]进一步优选的，所述阳性对照包括质粒DNA和野生型DNA混合物；所述阴性对照包括无核酸酶水。所述NEB universal probe qPCR master mix包括Buffer，Taq酶和dNTP。
[0015]作为一种具体实施方案，试剂盒的组成、不同反应管的突变类型和EGFR突变检测位点如下表2
‑
4所示：
[0016]表2试剂盒组成
[0017][0018][0019]表3试剂盒不同反应管的突变类型
[0020][0021]表4 EGFR突变检测位点
[0022][0023][0024]本专利技术还提供了上述引物和探针组合物，或上述试剂盒在基于多重荧光pcr检测EGFR突变中的应用。
[0025]本专利技术最后提供了一种多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，包括如下步骤：
[0026](1)准备样品；
[0027](2)构建多重荧光PCR扩增反应体系，包括分别由上述的组1、组2和组3构成的三种反应体系，进行PCR反应；
[0028](3)根据荧光PCR扩增仪显示的
△
ct值判定检测结果。
[0029]优选的，步骤(1)中，所述样品包括组织样本，FFPE样本或胸腹水样本。
[0030]优选的，步骤(2)中，所述三种反应体系包括：
[0031]19del&L858R体系：权利要求1所述的组1、NEB universal probe qPCR master mix、样本；
[0032]L858R&EGFR 20ins体系：权利要求1所述的组2、NEB universal probe qPCR master mix、样本；
[0033]T790M&L861Q&G719体系：权利要求1所述的组3、NEB universal probe qPCR master mix、样本。
[0034]实际应用时，上述反应体系中的样本包括待测样本、阳性对照或阴性对照。
[0035]作为一种具体实施方案，上述三种体系的具体组成如下所示：19del&S768I体系
[0036][0037][0038]L858R&EGFR 20ins体系
[0039][0040]T790M&L861Q&G719X体系
[0041][0042]优选的，步骤(2)中，所述PCR反应的条件如下：
[0043]第一阶段：95℃，1min，1个循环；
[0044]第二阶段：95℃，15s，64℃，30s，10个循环；
[0045]第三阶段：95℃，15s，60℃，30s，38个循环；
[0046]信号收集：第三阶段60℃时收集FAM/VIC/ROX/CY5信号，执行实时PCR，保存文件。
[0047]优选的，步骤(3)中，所述根据
△
ct值判定检测结果的方法如下：
[0048]突变由FAM/ROX/CY5信号指示，内控由VIC信号指示，通过计算
△
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种多重荧光pcr检测EGFR基因突变的引物和探针组合物，其特征在于，所述组合物包括19del、S768I、L858R、EGFR 20ins、T790M、L861Q、G719X及内控的引物和探针，上述引物和探针分为组1、组2和组3，如下表所示：
。2.一种多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合物。3.根据权利要求2所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：NEB universal probe qPCR master mix、权利要求1所述的引物和探针组合物、阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求3所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括质粒DNA和野生型DNA混合物；所述阴性对照包括无核酸酶水。5.权利要求1所述的引物和探针组合物，或权利要求2所述的试剂盒在基于多重荧光pcr检测EGFR突变中的应用。6.一种多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)准备样品；(2)构建多重荧光PCR扩增反应体系，包括分别由权利要求1所述的组1、组2和组3构成的三种反应体系，进行PCR反应；(3)根据荧光PCR扩增仪显示的
△
ct值判定检测结果。7.根据权利要求6所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样品包括组织样本，FFPE样本或胸腹水样本。8.根据权利要求6所述的多重荧光pcr检测EGFR突变的方法，其特征在于，步骤(2)中...
【专利技术属性】
技术研发人员：高如霞，孙克京，洪兵，邢红兵，
申请(专利权)人：江苏吉诺思美精准医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。