一种检测受体样品中供体的存在或比例的方法和试剂盒技术

本申请涉及一种检测供体来源的样品与受体来源的样品的SNP位点的方法。进一步的，本申请还涉及一种检测受体样品中供体的存在或其比例的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。以及用于实施所述方法的试剂盒。以及用于实施所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种检测受体样品中供体的存在或比例的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请涉及一种检测供体来源的样品与受体来源的样品的SNP位点的方法。进一步的，本申请还涉及一种检测受体样品中供体的存在或其比例的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]异源DNA是指个体自身体内存在来自一个或多个个体的非自身DNA，相对于个体自身DNA而言，来自一个或多个个体的非自身DNA可定义为异源DNA。最常见的例子是同种异体移植时受体体内存在供体来源的DNA，目前对异源DNA的检测方法可应用于骨髓移植和实质性器官移植两大方面。
[0003]在骨髓移植中，同种异源基因造血干细胞移植(Allo
‑
HSCT)是许多恶性血液病和一些非恶性疾病的主要治疗手段。针对移植后造血干细胞嵌合状态的检测方法主要根据例如红细胞抗原、人类白细胞抗原分型、短串联重复序列分析(STR
‑
PCR)等人群中所具有的多态性遗传标记。目前国际骨髓移植登记组已将STR
‑
PCR分析技术列为HSCT术后用于定量监测供体细胞嵌合状态的金标准，但其缺陷是竞争性扩增产生的非特异性干扰、基因漏扩现象所产生的影子(Stutter)条带。有研究发现当供体和受体细胞比例在5％
‑
10％以下时，敏感度会明显降低(Bone Marrow Transplant,2001,28(5):511
‑
8)。其它类型特异性标记的嵌合体检测方法被报道(J Mol Diagn,2009,11(1):66
‑
74)，但仍存在样本通量低、耗材成本高、检测灵敏度差、实验操作复杂等缺点。
[0004]目前实体器官移植术后移植物的监测常采用抽血进行肾、肝功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、ALT、AST、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确地反映移植物的状况。根据对于目前金标准的组织活检，其虽可直接地反映移植物的状况，但存在侵入式检测引起的感染或损伤；检出异常时损伤比治疗滞后；穿刺病灶部位的取样可能定位不准确等问题。Stephen R.Quake等人研究表明(Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(15):6229
‑
6234.)，受体血浆中异源的供体游离DNA(donor
‑
derived cell free DNA,dd
‑
cfDNA)比例可一定程度上反应移植物的状态。
[0005]目前，对dd
‑
cfDNA含量检测大多是基于人类遗传多态性信息(Sci Transl Med.2014；6(241):241ra77.)，或基于表观遗传学修饰变化(Gut.2018；67(12):2204
‑
2212.)。Beck J等人研究报道(Clin Chem,2013,59(12):1732
‑
41.)，在对肝脏、肾脏和心脏移植患者术后的早期研究中，通过qPCR技术分析供体异源的单核苷酸多态性信息，用dPCR技术对移植后受体血浆中dd
‑
cfDNA比例进行测定。Grskovic等使用二代测序技术(Next
‑
Generation Sequencing,NGS)平台上进一步开发和改进为对大量SNP位点进行同步检测，并在大量心脏移植术后患者的dd
‑
cfDNA比例实时监测中得到了可靠的验证(J Mol Diagn,2016,18(6):890
‑
902.)。中国专利技术专利中公开了一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法(CN106544407A)，通过NGS对目标区域捕获测序，从而获得受体样本的大量SNP基因分型信息；同时对移植后受体的血浆cfDNA样本进行目标区域的捕获和测序，用以
分析dd
‑
cfDNA占总cfDNA的比例。然而上述方法在应用于检测异源基因组DNA或异源游离DNA时还存在如下问题：NGS技术方案实验操作繁琐，检测周期长(3
‑
7个工作日)，且检测费用高，不适合用于移植后定期监测；而其它常规技术对遗传多态性信息检测时存在通量低、操作步骤多、检测灵敏度偏低、开盖易污染等缺点。

技术实现思路

[0006]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0007]如本文中所使用的，术语“供体”是指已经或拟向其他个体(受体)提供用以移植的器官、组织或细胞的个体。在某些实施方案中，所述供体已经或拟向其他个体(受体)提供用以移植的器官(例如，肾脏，心脏，肺脏，肝脏，胰脏或其任何组合)。在某些实施方案中，所述供体已经或拟向其他个体(受体)提供用以移植的造血干细胞(例如骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞)或含有造血干细胞的组织或器官(例如骨髓)。
[0008]如本文中所使用的，术语“受体”是指已经或拟接受或移植其他个体(供体)提供的用以移植的器官、组织或细胞的个体。在某些实施方案中，所述受体已经或拟接受或移植其他个体(供体)提供的器官(例如，肾脏，心脏，肺脏，肝脏，胰脏或其任何组合)。在某些实施方案中，所述受体已经或拟接受或移植其他个体(供体)提供的造血干细胞(例如骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞)或含有造血干细胞的组织或器官(例如骨髓)。
[0009]如本文中所使用的，术语“个体”是指任何生物个体。在某些实施方案中，所述个体是动物个体，例如哺乳动物(例如，人、鼠、兔、马、羊等)个体。
[0010]如本文中所使用的，术语“供体嵌合率”或“供体细胞嵌合率”是指受体在接受异体或异种移植物后，供、受体细胞相互移行、相互存在的现象，可用于评估异基因造血干细胞移植疗效的医疗检测指标，其结果对移植后复发有警示作用，能够提示临床提早进行干预。
[0011]如本文中所使用的，术语“供体游离DNA比例”或“dd
‑
cfDNA比例”是一种潜在的，可用于评估器官移植术后排异反应的检测指标，来源于移植物细胞凋亡和坏死过程中释放至血浆的游离DNA，其结果对移植物损伤程度有指示作用，能够指导临床提早进行干预。
[0012]如本文中所使用的，术语“聚类分析”是指将物理或抽象对象的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程。聚类分析的目标就是在相似的基础上收集数据来分类。聚类源于很多领域，包括数学，计算机科学，统计学，生物学和经济学。在不同的应用领域，这些技术方法被用作描述数据，衡量不同数据源间的相似性，以及把数据源分类到不同的簇中。
[0013]如本文中所使用的，术语“SNP(单核苷酸多态性)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。术语“SNP位点”为基因组中具有单本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测供体与受体具有不同基因型别的SNP位点的方法，其包括以下步骤:(a)提供含有来源于所述供体的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述受体的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物包含第一通用序列；所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，分别扩增第一样品和第二样品中的靶核酸，从而获得分别与第一样品和第二样品对应的扩增产物；(c)对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，确定这样的SNP位点：在该位点上第一样品和第二样品具有不同基因型别；优选地，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定第一样品和第二样品的各个候选SNP位点的型别，从而检测供体与受体具有不同基因型别的SNP位点；优选地，所述受体已经或拟接受或移植来自供体的器官、组织或细胞；优选地，所述受体已经或拟接受或移植来自供体的器官(例如，肾脏，心脏，肺脏，肝脏，胰脏或其任何组合)；优选地，所述受体已经或拟接受或移植来自供体的造血干细胞(例如骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞或其任何组合)或含有造血干细胞的组织或器官(例如骨髓)；优选地，第二样品基本上不含有来自供体的核酸；优选地，第一样品来自所述供体；例如，所述第一样品包含来自所述供体的细胞或组织；例如，所述第一样品选自来自所述供体的皮肤，唾液，尿液，血液，毛发，指甲，或其任何组合；优选地，第二样品来自所述受体(例如，经历或未经历移植手术的受体)；例如，所述第二样品包含来自所述受体的细胞或组织；例如，所述第二样品选自来自所述受体的皮肤，唾液，尿液，血液，毛发，指甲，或其任何组合；优选地，在步骤(a)中，针对每一种候选SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测
探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述第一样品包含DNA(例如基因组DNA)；优选地，所述第二样品包含DNA(例如基因组DNA)。2.一种检测经历移植手术后的受体的样品中供体的核酸的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：(1)提供来自受体的含有核酸的待检样品，所述受体已经移植了供体的细胞、组织或器官；(2)鉴定一个或多个目标SNP位点，其中，在所述目标SNP位点上，受体具有包含第一等位基因的第一基因型别，且，供体具有包含第二等位基因的第二基因型别，其中，第一基因型别不同于第二基因型别，且第一等位基因不同于第二等位基因；(3)对所述待检样品中各个目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；然后，根据第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检样品中供体的核酸的存在或其比例；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来区分某个SNP位点上的不同等位基因，从而鉴定目标SNP位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定目标SNP位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测SNP的固相芯片、液相芯片)、基于qPCR的检测法(例如，Taqman探针法)、质谱法(如基于MassARRAY的iPLEX
TM Gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dHPLC)、电泳法(如SNPshot法)、基于熔解曲线分析的检测法；优选地，在步骤(2)中，通过基于多重PCR结合熔解曲线分析的检测法鉴定所述目标SNP位点；优选地，通过权利要求1描述的方法鉴定所述目标SNP位点；优选地，在步骤(3)中，通过数字PCR对所述样品中各个目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；优选地，通过下述方案进行步骤(3)：(I)从步骤(2)中选取至少1个(例如，1个，2个，3个，或更多个)目标SNP位点，并且，针对每一个选取的目标SNP位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，(I
‑
1)所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述目标SNP位点的核酸分子；(I
‑
2)所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且(ii)第一探针能够与含有所述目标SNP位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火
(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标SNP位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；(II)使用所述扩增引物组和探针组对所述受体样品进行数字PCR，对具有第一等位基因的核酸分子和具有第二等位基因的核酸分子进行定量检测；(III)根据步骤(II)的定量检测结果，确定所述待检样品中供体核酸的存在或其比例；优选地，所述第一探针在数字PCR反应过程中与具有第一等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；和，所述第二探针在数字PCR反应过程中与具有第二等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；优选地，所述第一探针在数字PCR反应过程中不与具有第二等位基因的核酸分子退火或杂交；和/或，所述第二探针在数字PCR反应过程中不与具有第一等位基因的核酸分子退火或杂交；优选地，在步骤(3)之前，对所述来自受体的待检样品进行预处理；优选地，所述预处理包括对样品进行核酸提取和/或对样品中的核酸进行富集(例如，通过浓缩和/或扩增)。3.权利要求1或2的方法，所述受体已经接受或移植了供体的造血干细胞(例如骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞或其任何组合)或含有造血干细胞的组织或器官(例如骨髓)；优选地，待检样品包含来自移植后受体的血液(例如，外周血)或其组分(例如，血细胞，血浆，单核细胞，粒细胞，T细胞，或其任何组合)；优选地，所述目标SNP位点是这样的SNP位点，在所述SNP位点上，受体具有包含纯合的第一等位基因的第一基因型别，且，供体具有包含纯合的第二等位基因的第二基因型别。4.权利要求1或2的方法，其中，所述受体已经接受或移植来自供体的器官(例如，肾脏，心脏，肺脏，肝脏，胰脏或其任何组合)；优选地，所述受体已经接受或移植来自供体的肾脏；优选地，待检样品包含来自移植后受体的血液(例如，外周血)或尿液(特别是在肾脏移植的情况下)；优选地，所述目标SNP位点是这样的SNP位点，在所述SNP位点上，供体具有包含纯合的第一等位基因的第一基因型别，且，受体具有包含纯合的第二等位基因的第二基因型别。5.权利要求1
‑
4任一项的方法，其中，所述方法的步骤(a)
‑
(b)通过包含下述步骤(I)
‑
(VI)的方案来进行：(I)提供所述第一样品，所述第二样品，所述第一通用引物和第二通用引物，以及，所述靶特异性引物对；以及任选地，所述检测探针；(II)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，核酸聚合酶，以及任选地，检测探针混合；(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和(VI)任选地，重复步骤(III)
‑
(V)一次或多次；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在步骤(III)中，在80
‑
105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性；(2)在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10
‑
20s，20
‑
40s，40
‑
60s，1
‑
2min，或2
‑
5min；(3)在步骤(IV)中，在35
‑
40℃，40
‑
45℃，45
‑
50℃，50
‑
55℃，55
‑
60℃，60
‑
65℃，或65
‑
70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交；(4)在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10
‑
20s，20
‑
40s，40
‑
60s，1
‑
2min，或2
‑
5min；(5)在步骤(V)中，在35
‑
40℃，40
‑
45℃，45
‑
50℃，50
‑
55℃，55
‑
60℃，60
‑
65℃，65
‑
70℃，70
‑
75℃，75
‑
80℃，80
‑
85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸；(6)在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10
‑
20s，20
‑
40s，40
‑
60s，1
‑
2min，2
‑
5min，5
‑
10min，10
‑
20min或20
‑
30min；(7)在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)；和(8)重复步骤(III)
‑
(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(III)
‑
(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)
‑
(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。6.权利要求2
‑
5任一项所述的方法，其中，所述扩增引物组的引物各自独立地具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述引物的长度为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
110nt，110
‑
120nt，120
‑
130nt，130
‑
140nt，140
‑
150nt；(2)所述引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(3)所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。7.权利要求2
‑
6任一项所述的方法，其中，所述第一探针和第二探针各自独立地具有选自下列的一个或多个特征：(1)所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；(2)所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
200nt，200
‑
300nt，300
‑
400nt，400
‑
500nt，500
‑
600nt，600
‑
700nt，700
‑
800nt，800
‑
900nt，900
‑
1000nt；(3)所述第一探针和第二探针各自独立地具有3'
‑
OH末端；或者，所述探针的3'
‑
末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端；(4)所述第一探针和第二探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10
‑
80nt或
更长的距离；(5)所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX
‑
350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ
‑
1或者BHQ
‑
2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；(6)所述第一探针和第二探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；(7)所述第一探针和第二探针具有不同的报告基团；优选地，所述第一探针和第二探针是可被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)降解的；(8)所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：SEQ ID NO:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163。8.一种鉴定受体具有包含纯合的第一等位基因的第一基因型别的SNP位点的方法，其包括以下步骤：(a)提供来自所述受体的第五样品，其中，所述第五样品含有来源于所述受体的一种或多种靶核酸，且基本上不含有来源于供体的核酸；所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物包含第一通用序列；所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，分别扩增第五样品中的靶核酸，从而获得与第五样品对应的扩增产物；(c)对步骤(b)获得的与第五样品对应的扩增产物进行熔解曲线分析；(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，鉴定这样的SNP位点：在该位点上，受体具有包含纯合的第一等位基因的第一基因型别；优选地，第五样品来自所述受体(例如，经历或未经历移植手术的受体)；例如，所述第五样品包含来自所述受体的细胞或组织；例如，所述第五样品选自来自所述受体的皮肤，唾液，尿液，血液，毛发，指甲，或其任何组合。优选地，在步骤(a)中，针对每一种候选SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选SNP位点的区
域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第五样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述第五样品包含DNA(例如基因组DNA)。9.一种检测经历了移植手术后的受体样品中供体的核酸的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：(1)提供来自受体的含有核酸的待检样品，所述受体已经移植了供体的细胞、组织或器官；(2)鉴定多个(例如至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个)这样的候选SNP位点，所述候选SNP位点在所述受体所属的物种中至少显示第一等位基因和第二等位基因，并且，在所述候选SNP位点上，受体具有包含纯合的第一等位基因的第一基因型别；(3)对待检样品的各个候选SNP位点的各等位基因分别进行定量检测；(4)根据步骤(3)的定量检测结果，从所述候选SNP位点中挑选这样的目标SNP位点：所述待检样品在该位点上显示出了第一等位基因的信号，以及第二等位基因的信号；(5)根据所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检受体样品中供体的核酸的存在或其比例；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来区分某个SNP位点上的不同等位基因，从而鉴定候选SNP位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定候选SNP位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测SNP的固相芯片、液相芯片)、基于qPCR的检测法(例如，Taqman探针法)、质谱法(如基于MassARRAY的iPLEX
TM Gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dHPLC)、电泳法(如SNPshot法)、基于熔解曲线分析的检测法；优选地，在步骤(2)中，通过基于多重PCR结合熔解曲线分析的检测法鉴定所述候选SNP位点；优选地，通过权利要求8描述的方法鉴定所述候选SNP位点；优选地，在步骤(3)中，通过数字PCR对各个候选SNP位点的各等位基因分别进行定量检测；优选地，通过下述方案进行步骤(3)：(I)从步骤(2)中选取多个(例如至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个)候选SNP位点，并且，针对每一个选取的候选SNP位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，(I
‑
1)所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述候选SNP位点的核酸分子；
(I
‑
2)所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且(ii)第一探针能够与含有所述候选SNP位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述候选SNP位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；(II)使用所述扩增引物组和探针组对所述来自受体的待检样品进行数字PCR，对具有第一等位基因的核酸分子和具有第二等位基因的核酸分子进行定量检测；优选地，所述第一探针在数字PCR反应过程中与具有第一等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；和，所述第二探针在数字PCR反应过程中与具有第二等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；优选地，所述第一探针在数字PCR反应过程中不与具有第二等位基因的核酸分子退火或杂交；和/或，所述第二探针在数字PCR反应过程中不与具有第一等位基因的核酸分子退火或杂交；优选地，在步骤(5)中，对多个(例如至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个)目标SNP位点的第二等位基因的定量检测结果进行聚类分析；然后，根据聚类分析结果，确定供体在各个目标SNP位点上的基因型别；然后，根据所述受体和供体在各个目标SNP位点上的基因型别，以及所述待检样品中第一等位基因和第二等位基因的定量检测结果，确定所述待检受体样品中供体的核酸的存在或其比例；优选地，在步骤(3)之前，对所述来自受体的待检样品进行预处理；优选地，所述预处理包括对样品进行核酸提取和/或对样品中的核酸进行富集(例如，通过浓缩和/或扩增)。10.权利要求8或9的方法，其中，所述受体已经接受或移植了供体的造血干细胞(例如骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞或其任何组合)或含有造血干细胞的组织或器官(例如脊髓)；优选地，所述待检样品包含来自移植后受体的血液(例如，外周血)或其组分(例如，血细胞，血浆，单核细胞，粒细胞，T细胞，或其任何组合)。11.权利要求8或9的方法，其中，所述受体已经接受或移植来自供体的器官(例如，肾脏，心脏，肺脏，肝脏，胰脏或其任何组合)；优选地，所述受体已经接受或移植来自供体的肾脏；优选地，待检样品包含来自移植后受体的血液(例如，外周血)或尿液(特别是在肾脏移植的情况下)。12.权利要求8
‑
11任一项所述的方法，其中，所述方法的步骤(a)
‑
(b)通过包含下述步骤(I)
‑
(VI)的方案来进行：(I)提供所述第五样品，所述第一通用引物和第二通用引物，以及，所述靶特异性引物对；以及任选地，所述检测探针；(II)将所述第五样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，核酸聚合酶，以及任选地，检测探针混合；
(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和(VI)任选地，重复步骤(III)
‑
(V)一次或多次；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在步骤(III)中，在80
‑
105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性；(2)在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10
‑
20s，20
‑
40s，40
‑
60s，1
‑
2min，或2
‑
5min；(3)在步骤(IV)中，在35
‑
40℃，40
‑
45℃，45
‑
50℃，50
‑
55℃，55
‑
60℃，60
‑
65℃，或65
‑
70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交；(4)在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10
‑
20s，20
‑
40s，40
‑
60s，1
‑
2min，或2
‑
5min；(5)在步骤(V)中，在35
‑
40℃，40
‑
45℃，45
‑
50℃，50
‑
55℃，55
‑
60℃，60
‑
65℃，65
‑
70℃，70
‑
75℃，75
‑
80℃，80
‑
85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸；(6)在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10
‑
20s，20
‑
40s，40
‑
60s，1
‑
2min，2
‑
5min，5
‑
10min，10
‑
20min或20
‑
30min；(7)在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)；和(8)重复步骤(III)
‑
(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(III)
‑
(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)
‑
(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。13.权利要求9
‑
12任一项所述的方法，其中，所述扩增引物组的引物各自独立地具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述引物的长度为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
110nt，110
‑
120nt，120
‑
130nt，130
‑
140nt，140
‑
150nt；(2)所述引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(3)所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。14.权利要求9
‑
13任一项所述的方法，其中，所述第一探针和第二探针各自独立地具有选自下列的一个或多个特征：(1)所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；(2)所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
200nt，200
‑
300nt，300
‑
400nt，400
‑
500nt，500
‑
600nt，600
‑
700nt，700
‑
800nt，800
‑
900nt，900
‑
1000nt；(3)所述第一探针和第二探针各自独立地具有3'
‑
OH末端；或者，所述探针的3'
‑
末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH上添加化学部分(例如，生物素或烷
基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端；(4)所述第一探针和第二探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10
‑
80nt或更长的距离；(5)所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX
‑
350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ
‑
1或者BHQ
‑
2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；(6)所述第一探针和第二探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；(7)所述第一探针和第二探针具有不同的报告基团；优选地，所述第一探针和第二探针是可被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)降解的；(8)所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：SEQ ID NO:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163。15.一种检测供体与受体具有不同基因型别的SNP位点的方法，其包括以下步骤:(a)提供来自所述受体的第三样品和来自经历移植手术后的受体的第四样品，其中，所述第三样品含有来源于所述受体的一种或多种靶核酸，且基本上不含有来源于供体的核酸；所述第四样品含有来源于所述供体的一种或多种靶核酸，并且，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物包含第一通用序列；所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，分别扩增第三样品和第四样品中的靶核酸，从而获得分别与第三样品和第四样品对应的扩增产物；(c)对步骤(b)获得的与第三样品和第四样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，确定这样的SNP位点：在该位点上第三样品仅显
示第一等位基因，且第四样品至少显示第二等位基因(例如，显示第一和第二等位基因)；所述SNP位点为供体与受体具有不同基因型别的SNP位点；优选地，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定第三样品和第四样品的各个候选SNP位点的型别，从而确定这样的SNP位点：在该位点上第三样品仅显示第一等位基因，且第四样品显示第一和第二等位基因；优选地，第三样品来自所述受体(例如，经历或未经历移植手术的受体)；例如，所述第三样品包含来自所述受体的细胞或组织；例如，所述第三样品选自来自所述受体的皮肤，唾液，尿液，血液，毛发，指甲，或其任何组合；优选地，在第四样品中，来自供体的核酸的量占第四样品中的总核酸的量的至少20％，例如至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，或者更高；优选地，所述受体已经接受或移植来自供体的器官、组织或细胞；例如，所述受体已经接受或移植来自供体的器官(例如，肾脏，心脏，肺脏，肝脏，胰脏或其任何组合)；优选地，所述第四样品包含来自经历移植手术后的受体血液(例如，外周血)或尿液(特别是在肾脏移植的情况下)；优选地，所述第四样品包含来自经历移植手术后不超过5天(例如不超过3天，2天或1天)的受体血液(例如，外周血)或尿液(特别是在肾脏移植的情况下)；例如，所述受体已经接受或移植来自供体的造血干细胞(例如骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞)或含有造血干细胞的组织或器官(例如骨髓)；优选地，所述第四样品包含来自经历移植手术后的受体的血液(例如外周血)或其组分(例如血细胞)；优选地，所述第四样品包含来自经历移植手术后至少5天(例如至少10天，至少15天，至少20天，至少30天)的受体的血液(例如外周血)或其组分(例如血细胞)；优选地，在步骤(a)中，针对每一种候选SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第三样品和第四样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述第三样品包含DNA(例如基因组DNA)。优选地，所述第四样品包含DNA(例如基因组DNA)。16.一种检测经历移植手术后的受体的样品中供体的核酸的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：(1)提供来自受体的含有核酸的待检样品，所述受体已经移植了供体的细胞、组织或器官；(2)鉴定多个(例如至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个)目标SNP位点，其中，在所述目标SNP位点上，受体具有包含纯合的第一等位基因的第一基因型别，且，供体具有包含第二等位基因的第二基因型别，其中，第一基因型别不同于第二基因型别，且第一等位基因不同于第二等位基因；
(3)对所述待检样品中各个目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；(4)根据所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检受体样品中供体的核酸的存在或其比例；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来区分某个SNP位点上的不同等位基因，从而鉴定目标SNP位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定目标SNP位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测SNP的固相芯片、液相芯片)、基于qPCR的检测法(例如，Taqman探针法)、质谱法(如基于MassARRAY的iPLEX
TM Gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dHPLC)、电泳法(如SNPshot法)、基于熔解曲线分析的检测法；优选地，在步骤(2)中，通过基于多重PCR结合熔解曲线分析的检测法鉴定所述目标SNP位点；优选地，通过权利要求15描述的方法鉴定所述目标SNP位点；优选地，在步骤(3)中，通过数字PCR对所述样品中各个目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；优选地，通过下述方案进行步骤(3)：(I)针对每一个目标SNP位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，(I
‑
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，黄秋英，陈昕雯，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：