一种检测靶核酸拷贝数重复的方法和试剂盒技术

本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请涉及一种检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法以及试剂盒。本发明专利技术的方法简单、高效且低成本。高效且低成本。高效且低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种检测靶核酸拷贝数重复的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请涉及一种检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法以及试剂盒。

技术介绍

[0002]基因组拷贝数变异(Copy number variation,CNV)，通常是指基因组DNA插入、缺失或者重复一段大于50bp的片段。CNV在人类基因组上广泛分布，不仅可以作为一种多态性遗传标记参与人类的进化进程，还与多种疾病密切相关，比如染色体非整倍体异常、染色体整倍体异常、亚端粒重复、常见微缺失/微重复等多种遗传病。目前CNV的检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、定量PCR(qPCR)技术、多重连接探针扩增(MLPA)技术、微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)和高通量测序技术(NGS)。
[0003]荧光原位杂交通过特异性寡核苷酸荧光探针检测分裂中期染色体，可明确染色体来源和染色体结构异常部分。该技术对染色体缺失、重复或易位等检测特异性高，检测周期仅1
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2天。但该技术检测通量受镜检技术工作量大、实验操作过程较繁琐并且耗时长的影响而无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测待测样本的基因组中靶核酸拷贝数重复的方法，其包括以下步骤:(a)提供含有来源于所述待测人样本的靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，提供通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述通用引物包含第一通用序列；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述通用引物以及所述靶特异性引物对，通过扩增样品中的靶核酸，从而获得扩增产物；(c)对步骤(b)获得的扩增产物进行熔解曲线分析，并获得各SNP位点的基因型别；(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，挑选至少一个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因；(e)计算所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因对应的熔解峰峰高Rm的比值HR
待测
，并计算所述HR
待测
与参考值的比值NHR
待测
；将所述比值NHR
待测
与参考范围进行比较，从而判断待测样本的靶核酸拷贝数是否重复；其中，所述参考值为正常人在所述目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因对应的Rm的比值HR
对照
的平均值，且所述参考范围为正常人基因组中所述目标SNP位点的归一化峰高比值NHR
对照
的波动范围；优选地，所述靶核酸为染色体(例如，常染色体)。2.权利要求1的方法，其中，所述参考值和所述参考范围通过如下方法获得:(I)提供含有来源于多个健康人样本(例如，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，或更多个)的靶核酸的多个样品(例如，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，或更多个)，每一种靶核酸均包含一种或多种候选SNP位点，并且，提供通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述通用引物包含第一通用序列；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多
个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(II)在允许核酸扩增的条件下，使用所述通用引物以及所述靶特异性引物对，扩增所述靶核酸，从而获得扩增产物；(III)对步骤(II)获得的与各样本对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析，并获得各SNP位点的基因型别；(IV)根据步骤(III)的熔解曲线分析结果，挑选至少一个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)杂合的SNP位点作为目标SNP位点，在所述目标SNP位点上具有第一等位基因和第二等位基因；(V)计算各样本中所述目标SNP位点上第一等位基因和第二等位基因对应的熔解峰峰高Rm的比值HR
对照
，计算HR
对照
的平均值即获得所述参考值；并且，计算各样本中所述目标SNP位点上HR
对照
与所述参考值的比值NHR
对照
，并获得NHR
对照
的平均值和标准差(SD)，各样本中所述目标SNP位点上NHR
对照
的平均值
±
3SD的范围即为所述参考范围。3.权利要求1或2的方法，其中，在步骤(e)中，通过如下方法判断待测样本的靶核酸拷贝数是否重复：当所述NHR
待测
处于所述参考范围内，所述靶核酸的核苷酸序列正常；当所述NHR
待测
处于所述参考范围外(例如，大于或小于)，所述靶核酸的核苷酸序列发生重复。4.权利要求1
‑
3任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述方法用于检测1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个，20
‑
50个或更多个靶核酸的拷贝数；(2)在所述方法的步骤(a)中，提供1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个，20
‑
50个或更多个靶特异性引物对；(3)在所述方法的步骤(b)中，所述通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1
‑
5倍，5
‑
10倍，10
‑
15倍，15
‑
20倍，20
‑
50倍或更多倍；(4)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；(5)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶；(6)所述靶核酸的序列长度至少为5bp(例如，至少为10bp，至少为20bp，至少为30bp，至
少为40bp，至少为50bp，至少为60bp，至少为70bp，至少为80bp，至少为90bp，至少为100bp，至少为500bp，至少为1000bp)；(7)所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)；优选地，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：(i)所述候选SNP位点之间的距离大于1kb；(ii)所述候选SNP位点为二态性SNP位点；(iii)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.4至0.6之间；(8)在步骤(c)中，通过实时荧光PCR仪的配套软件获得(例如，SLAN全自动医用PCR分析系统8.2.2)各SNP位点上各等位基因对应的熔解峰峰高(Rm)。5.权利要求1
‑
4任一项的方法，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；(3)所述检测探针的长度为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
200nt，200
‑
300nt，300
‑
400nt，400
‑
500nt，500
‑
600nt，600
‑
700nt，700
‑
800nt，800
‑
900nt，900
‑
1000nt；(4)所述检测探针具有3'
‑
OH末端；或者，所述检测探针的3'
‑
末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端；(5)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10
‑
80nt或更长的距离；
(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX
‑
350,FAM,VIC,TET,CALGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ
‑
1或者BHQ
‑
2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；(7)所述检测探针无抵抗核酸酶活性，或者具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'
‑
O
‑
氨基丙基修饰，2'
‑
O
‑
烷基修饰，2'
‑
O
‑
烯丙基修饰，2'
‑
O
‑
丁基修饰，和1
‑
(4'
‑
硫代
‑
PD
‑
呋喃核糖基)修饰；(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。6.权利要求1
‑
5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(2)所述第一通用序列位于或构成所述通用引物的3'部分；(3)所述通用引物的长度为5
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，或40
‑
50nt；(4)所述通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。7.权利要求1
‑
6任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；(4)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；(5)所述正向核苷酸序列的长度为10
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt；(6)所述正向引物的长度为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，黄秋英，刘颖，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：