一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种单碱基分辨率检测RNA中N6‑

【技术实现步骤摘要】
一种单碱基分辨率检测RNA中N6
‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的方法


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种单碱基分辨率检测RNA中N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的方法。

技术介绍

[0002]RNA不仅由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)四种碱基组合而成，RNA中还含有多种多样的转录后修饰形式，这些化学修饰具有重要的生物学功能。目前为止，已经发现了超过150多种的RNA转录后修饰。并且RNA转录后修饰分布广泛，几乎存在于所有类型RNA中，其中存在修饰方式最多的是tRNA；此外，在mRNA、rRNA、小核RNAs(Small nuclear RNAs，snRNAs)、微型RNAs(microRNAs，miRNAs)中也发现越来越多的修饰位点以及修饰类型。常见的RNA修饰包括N6‑
甲基腺苷(N6‑
methyladenosine，m6A)、假尿苷(pseudouridine)、5
‑
甲基胞苷(5
‑
methylcytidine，m5C)、2'
‑
O
‑
核糖甲基化(2'
‑
O
‑
ribosemethylation)和N1‑
甲基腺苷(N1‑
methyladenosine，m1A)，这些修饰在很大程度上丰富了RNA的遗传与功能多样性。目前研究较多的是m6A修饰。RNA中腺嘌呤还有一种修饰形式，N6‑
异戊烯基腺嘌呤(i6A)，被发现分布在细菌和真核生物的tRNA中靠近反密码子的37号位，可以稳定密码子和反密码子的识别继而增强翻译的过程。
[0003]修饰的鉴定及测序方法是研究其生物学意义的前提条件。作为一种稀有碱基，N6‑
异戊烯基腺嘌呤的检测以及生物学功能研究十分有限。目前，异戊烯基腺嘌呤常用的检测方法是利用i6A抗体进行免疫学测定方法，该类方法可以检测出哪些转录本或基因组中含有i6A修饰，但分辨率限制在上百碱基范围，不能具体区分哪个A被甲基化，也不能区分是单个A还是团簇的A被甲基化；并且是基于抗体富集i6A序列片段从而间接鉴定i6A修饰位点，没有通过直接检测i6A位点突变来鉴定修饰位点。因此，亟待开发一种针对RNA中N6‑
异戊烯基腺嘌呤进行单碱基分辨率检测直接有效的手段。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种单碱基分辨率检测RNA中N6
‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，旨在解决现有基于抗体免疫沉淀的间接检测方法分辨率低的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种单碱基分辨率检测RNA中N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，包括如下步骤：
[0006]S1、向待检测RNA中加入碘，RNA上的N6‑
异戊烯基腺嘌呤和碘发生加成反应，使得所述N6‑
异戊烯基腺嘌呤的N1和N6位形成环化结构；
[0007]S2、向加成反应后的RNA中加入AMV逆转录酶，RNA中的N1，N6环化腺嘌呤在AMV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，碱基互补配对时出现错误，通过核酸测序手段识别突变位点，从而得到RNA上N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰位点。
[0008]优选地，步骤S1具体为：将待检测RNA溶于碘的碘化钾溶液，于20℃～40℃下振荡
反应5min～15min，然后向反应液中逐滴滴加饱和硫代硫酸钠溶液至溶液澄清，再缓慢滴加饱和碳酸钠溶液或饱和碳酸氢钠溶液至没有气泡产生。
[0009]优选地，步骤S2具体为：先利用AMV逆转录酶逆转录环化后的RNA；再采用RNA文库制备技术结合高通量测序手段进行全转录组N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别，或者采用PCR与TA
‑
cloning技术进行特定转录本上N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别与验证。
[0010]优选地，所述待检测RNA通过提取细胞总RNA，再富集N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的RNA得到。
[0011]进一步优选地，在提取细胞总RNA之前，将N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸与所述细胞共培养一段时间，所述N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的浓度为100μM～400μM。
[0012]优选地，所述待检测RNA通过靶基因序列的体外转录得到，转录底物中含有N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。
[0013]进一步优选地，所述体外转录具体包括：构建利用T7启动子启动所述靶基因表达的表达载体，以所述表达载体为模板，利用T7RNA聚合酶催化所述转录底物合成待检测RNA。
[0014]进一步优选地，所述转录底物中包含等物质的量的rATP、rCTP、rGTP和rUTP，以及2倍
‑
16倍于rATP的物质的量的N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。
[0015]进一步优选地，所述N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的物质的量是rATP的物质的量的2倍
‑
8倍。
[0016]进一步优选地，所述N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸用分子探针进行标记，所述分子探针含有能够与N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸中的异戊烯基团特异性反应的功能性分子和荧光标记分子，所述功能性分子为亲电氟化试剂、苯胺衍生化的亚硝基类化合物或1,2,4
‑
三唑啉
‑
3,5
‑
二酮类衍生物，所述亲电氟化试剂为1
‑
氟
‑4‑
甲基
‑
1,4
‑
二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、1
‑
氯甲基
‑4‑
氟
‑
1,4
‑
二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、N
‑
氟苯磺酰亚胺或N
‑
氟吡啶三氟甲磺酸盐，所述苯胺衍生化的亚硝基类化合物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团，所述1,2,4
‑
三唑啉
‑
3,5
‑
二酮类衍生物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团。
[0017]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0018](1)异戊烯基腺嘌呤核苷(iPA)是一种自然界存在的主要的游离天然细胞分裂素，这种细胞分裂素与植物的生长发育有着密切的关系，包括种子的萌发、细胞增殖、维管束发育、顶端优势和叶的衰老等，对其的研究具有重要意义。本专利技术提出的一种单碱基分辨率检测RNA N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的检测和标记方法，通过N6‑
异戊烯基腺嘌呤和碘反应成环，所生成的结构无法形成氢键，使得该位点碱基会产生随机配对，继而被识别出来，是基于核酸腺嘌呤的化学标记与诱导突变，由于突变位点可以精确本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单碱基分辨率检测RNA中N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、向待检测RNA中加入碘，RNA上的N6‑
异戊烯基腺嘌呤和碘发生加成反应，使得所述N6‑
异戊烯基腺嘌呤的N1和N6位形成环化结构；S2、向加成反应后的RNA中加入AMV逆转录酶，RNA中的N1，N6环化腺嘌呤在AMV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，碱基互补配对时出现错误，通过核酸测序手段识别突变位点，从而得到RNA上N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：将待检测RNA溶于碘的碘化钾溶液，于20℃～40℃下振荡反应5min～15min，然后向反应液中逐滴滴加饱和硫代硫酸钠溶液至溶液澄清，再缓慢滴加饱和碳酸钠溶液或饱和碳酸氢钠溶液至没有气泡产生。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：先利用AMV逆转录酶逆转录环化后的RNA；再采用RNA文库制备技术结合高通量测序手段进行全转录组N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别，或者采用PCR与TA
‑
cloning技术进行特定转录本上N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别与验证。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的方法，其特征在于：所述待检测RNA通过提取细胞总RNA，再富集N6‑
异戊烯基腺嘌呤修饰的RNA得到。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在提取细胞总RNA之前，将N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸与所述细胞共培养一段时间，所述N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的浓度为100μM～400μM。6.根据权利要求1
‑
3任一所述的方法，其特征在于：所述待检测RNA通过靶基因序列的体外转录得到，转录底物中含有N6‑
异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锐，王升，李源源，周红玲，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：