单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物，所述特异性引物的3

Application and kit of single primer amplification library building technology in detecting molecular mutations of fragmented rare DNA

【技术实现步骤摘要】
单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，涉及利用单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用，以及试剂/试剂盒。

技术介绍

[0002]DNA突变是多种疾病的主要成因，癌症就是由DNA突变引起的疾病之一。通过突变检测可以对癌症患者进行分子分型，从而对症治疗，获得更好的疗效。下一代测序(NGS)是一种常用的突变检测技术。NGS检测流程中，一般需要对目标DNA进行扩增或富集以确保目标DNA分子的数量和浓度达到可被NGS测序仪检出的程度；同时还需要在目标DNA分子的两端上加上测序序列才能在测序时被测序引物在测序载体上簇化扩增，进行高通量测序。这种对目标DNA扩增并加上测序序列使之能被NGS测序仪测序的过程称之为“文库构建”，简称“建库”。
[0003]近年来精准医学的发展对NGS检测性能要求日渐提高，不但要求可以准确无误的检出目标DNA序列，并且需要检出数量极为稀少的目标DNA分子中的稀有突变(如外周血中的循环肿瘤DNA，ctDNA)。有文献指出(Phylogenetic ctDNA analysis depicts early stage lung cancer evolution，Nature 2017)，在早中期恶性肿瘤患者的外周血中仅含有0.1％以下的ctDNA分子。这些极其稀有的ctDNA分子与外周血其他正常细胞代谢的循环游离DNA(cfDNA)分子极其相似，仅在个别位点上存在突变。如何能有效识别稀有ctDNA分子的突变，对NGS的建库技术的要求上除了提高DNA分子的转化效率之外，降低文库构建/测序时产生的碱基错误(噪声)也十分重要。
[0004]基于PCR的测序是目前主流的测序方法之一。PCR法结合前后引物(双端引物)、DNA聚合酶和dNTP，通过对反应混合物的温度控制(变性、退火、延伸)进行目标序列的扩增。对于稀有DNA分子的突变，基于PCR的测序没法有效检测，容易形成假阳性/假阴性结果，原因如下：1.PCR指数扩增的特性(每一轮扩增生成的产物都可以成为下一轮扩增的模板)容易累积引入的错误突变，影响其检测准确性。2.步骤上，一般先进行接头连接，再进行PCR扩增，因为受限于连接酶的效率容易造成漏检。3.PCR检测的灵敏度受限于待测核酸分子长度和PCR扩增子长度的比值，在实际检测中，考虑到引物和检测探针的设计难度，通常对于100
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200bp左右的DNA分子，其实际检出效率约在20％左右，远达不到单个分子的水平。4.一般使用不具有纠错功能(即3'
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5'内切酶功能，可剪切错配碱基从而确保产物的“保真性”)的DNA聚合酶进行，容易在扩增过程中引入错误突变。5.一般使用单端的样本标签，容易受样本标签的生产质量影响而降低对稀有DNA分子突变的检测准确性(受限于生产工艺，样本标签存在约千分之一的碱基错误，容易导致测序数据的分析问题，影响稀有DNA分子的检测)。6.一般未有利用分子标签序列进行去重分析，没法去除建库/测序时引入的错误突变。因此，如何抑制测序错误(降低噪声)和尽量捕获所有的目标DNA分子(避免漏检)，从而有效提高测序结果的准确性，是基因检测
亟需解决的技术问题。
[0005]理论上，线性扩增(即通过单个引物捕获并延伸每一个目标区域，每一轮的扩增都只以原始样本中的DNA分子为模板的DNA扩增方式)是一种改善片段化DNA分子突变检出率的潜在方法。但现有技术中的DNA线性扩增的效率有限，要数十个循环才能达到预期的扩增倍数，一旦扩增中出现非特异的PCR指数扩增反应，则会耗尽反应中的底物，令线性扩增无法实现。非特异扩增出现的原因主要有三种：1)引物之间形成的二聚体，由于多重扩增体系中会使用数十种甚至上百种引物，相对反应模板浓度更高，引物之间形成的二聚体(引物的3
’
端间相互错配扩增形成的产物)，会导致引物之间的PCR反应。2)引物脱靶产生非特异性PCR，在多重检测多个目标DNA序列的情况下，引物自身的降解所导致的脱靶结合容易与其他的引物形成PCR反应。3)高保真聚合酶引起的脱靶扩增，一般情况下，引物脱靶结合的DNA序列只要在3
’
端存在错配碱基，其扩增效率会显着下降。但是在应用高保真聚合酶的情况下，DNA聚合酶的3
’‑5’
外切酶区域会对错配碱基进行剪切，令引物脱靶结合的DNA序列也能扩增，最终形成大量的脱靶产物。
[0006]受限于上述问题，现有的技术无法对稀有的突变进行有效检测。因此NGS的应用普遍局限于晚期癌症患者的伴随诊断，无法有效检测早中期癌症患者血液中的稀有突变DNA分子。准确的检出血液中的稀有DNA分子突变以发现并区分出ctDNA分子是实现癌症早期筛查的一种方式，是实现癌症早诊早治、改善癌症患者生存质量的潜在途径，意义重大。

技术实现思路

[0007]为克服现有技术存在的上述缺点，本专利技术的目的在于提供一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用。所述单引物扩增建库技术高灵敏度检测样本中极低拷贝数的稀有突变分子。同时在临床患者样本中，可以检测出早期癌症患者血液样本中的ctDNA分子。
[0008]所述片段化稀有DNA分子突变的丰度为0.001％～50％，优选为0.01％～10％，最优选为0.02％～1％。
[0009]本专利技术提供了一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物，所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有二象性功能基团；(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头。
[0010]所述片段化稀有DNA分子突变包括单碱基变异(SNV)和短片段插入/缺失(small indel)。
[0011]本专利技术应用中，所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有二象性功能基团且部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰；所述特异性引物的3
’
末端的核苷酸的3位C原子羟基被二象性功能基团取代，所述特异性引物的3
’
末端的二象性功能基团选自C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2‑
C6基团、SH
‑
C6基团；
[0012]和/或，所述特异性引物的3
’
末端的二象性功能基团为核苷酸复合基团，核苷酸复合基团的结构如下：
[0013][0014]其中，Base选自A碱基、G碱基、C碱基、T碱基或U碱基；
[0015]R1选自羟基基团、C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2‑
C6基团或SH
‑
C6基团；
[0016]R2选自氢原子、氟原子、羟基基团、或甲氧基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用，其特征在于，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物，所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有二象性功能基团；(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；所述片段化稀有DNA分子突变包括单碱基变异(SNV)和短片段插入/缺失(small indel)。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括将所述连接产物进行预扩增、扩库、测序的步骤；其中，所述预扩增的步骤为：将所述连接产物进行预扩增，以提供预扩增产物，所述的预扩增引物的前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合，所述的预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列；所述扩库的步骤为：将所述预扩增产物进行扩库，以提供文库产物，所述的扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列，所述的扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列；所述测序的步骤为：通过对所述文库产物进行测序，以提供片段化稀有DNA分子目标区域的测序结果。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有二象性功能基团；所述特异性引物的3
’
末端的核苷酸的3位C原子羟基被二象性功能基团取代，所述特异性引物的3
’
末端的二象性功能基团选自C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2‑
C6基团、SH
‑
C6基团；和/或，所述特异性引物的3
’
末端的二象性功能基团为核苷酸复合基团，核苷酸复合基团的结构如下：其中，Base选自A碱基、G碱基、C碱基、T碱基或U碱基；R1选自羟基基团、C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2‑
C6基团或SH
‑
C6基团；R2选自氢原子、氟原子、羟基基团、或甲氧基基团。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性引物的3
’
端部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰；其中，所述特异性引物中，被硫代修饰的核苷酸的个数为1～11个，优选为3～8个；和/或，所述特异性引物中，被硫代修饰的核苷酸为连续的；和/或，所述特异性引物中，位于特异性引物的3
’
端的被硫代修饰的核苷酸的个数为1
‑
11个，优选为3
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8个。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线性扩增包括多重线性扩增；所述多...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，
申请(专利权)人：上海羿鸣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：