一种优化的扩增目标核酸的聚合酶、复合体系及应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种优化的扩增目标核酸的方法，包括：使结合了引物的模板和至少部分经标记分子修饰的dNTP，以及具有3'

【技术实现步骤摘要】
一种优化的扩增目标核酸的聚合酶、复合体系及应用
[0001]本申请是如下申请的分案申请：
[0002]专利技术名称：一种优化的扩增目标核酸的聚合酶、复合体系及应用
[0003]申请号：202010393420.6
[0004]申请日：2020年5月11日
[0005]申请人：南京君华基因科技有限公司；上海羿鸣生物科技有限公司


[0006]本专利技术涉及生物
，更具体地说，涉及一种优化的扩增并纯化目标核酸的方法和体系。

技术介绍

[0007]对于靶向扩增技术而言，扩增纯化后得到产量和纯度都足够的目标产物非常关键。现有技术对于核酸扩增后目标产物的纯化方式主要包括固相载体吸附法，比如吸附柱法或固相可逆磁珠法，利用的是载体对核酸本身较强的亲和力和吸附力；分子筛法，通过分子量大小的不同来筛选目标分子；电泳法，通过电泳分析，将目标分子量的核酸纯化回收；亲和纯化，用标记物标记探针或引物，利用固相载体通过标记物的亲和性来纯化目标DNA分子。
[0008]鉴于通量和成本，目前在二代测序建库中常用的是基于标记物与固相载体亲和性状的亲和纯化，比如用链霉亲和素包被的磁珠纯化用生物素标记的探针或引物扩增得到的扩增产物。该法相较其它三种纯化法而言，对于短片段或单链DNA回收率高，原始DNA模板转化率高，纯化产物中非核酸产物少，且适合不定长度的原始模板，但缺点是纯化产物中未结合模板的带有标记分子的游离探针或引物大量残留。
[0009]为了解决被标记的游离探针或引物在纯化产物中大量残留的问题，现有技术采用的另一种纯化方法是将标记分子标记在作为扩增反应底物的dNTP而不是探针或引物上，通过DNA聚合酶的酶促反应将被标记的dNTP掺入到扩增产物中，再利用亲和纯化获得目标纯化产物。通常，对于各种测试的dNTP类似物，扩增产物得率与经修饰的dNTP类似物掺入率之间存在反比关系，找到合适修饰的dNTP类似物作为反应底物不可或缺。然而，可以用生物素修饰的天然dNTP至少有四种，对这四种dNTP的不同位点进行不同碳链长度的生物素修饰更多达几十种，不同修饰的dNTP类似物其底物性能大相径庭，有的产物掺入率尚可但扩增得率很低。再考虑DNA聚合酶的问题，经过分子生物学至今的发展，天然与定向改造后的DNA聚合酶细分种类已多至不可数，其结构和性能千差万别，不同种类的DNA聚合酶与不同种类修饰物、修饰位点、混合比例的dNTP类似物配合使用，排列组合几乎无限，产物得率与纯化性能天差地别。现有技术只提到失去3'
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5'外切酶活性的DNA聚合酶可以在DNA扩增中掺入经生物素修饰的dNTP(Incorporation of reporter molecule
‑
labeled nucleotides by DNA polymerases.II.High
‑
density labeling of natural DNA，T Tasara,B Angerer,etc,Nucleic Acids Res.2003May 15；31(10):2636
–
2646.)，但3'
‑
5'外切酶活性失活的
DNA聚合酶不具有高保真性，不能满足靶向扩增技术准确富集目标核酸序列的需求。B类DNA聚合酶能够确保扩增序列的准确性，其3
’‑5’
外切酶活性使其较其他类别的DNA聚合酶有更高的碱基保真性。关于如何在保留DNA聚合酶3'
‑
5'外切酶活性的前提下找到合适的底物通过引物延伸法扩增不定长度的DNA，尤其是对于采用单链线性扩增技术的应用场景，现有技术未给出技术启示。其中所述的单链线性扩增是一种有别于传统PCR的目标核酸扩增技术，采用单端引物反复的对模板核酸进行结合和延伸扩增，因此扩增产物是以线性扩增而非指数扩增生成，这一特点可避免PCR引入碱基错误的累积，进一步确保扩增产物的准确性。

技术实现思路

[0010]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术提供了一种优化的扩增目标核酸的方法，包括下述步骤：
[0011]在反应体系中，以目标核酸分子为模板，加入引物，具有高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系，经扩增反应得到所述目标核酸的扩增产物；
[0012]其中，所述高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系包括dNTP和DNA聚合酶；
[0013]所述dNTP是至少部分经标记分子修饰的dNTP，经标记分子修饰的dNTP中不可有阻止修饰基团分子旋转的结构；
[0014]所述DNA聚合酶是具有3
’‑5’
外切酶活性的高保真聚合酶。
[0015]本专利技术另一方面提供一种优化的扩增目标核酸的体系，其包括适用于本专利技术第一方面提供的优化的扩增的方法的经标记分子修饰的dNTP类似物和DNA高保真聚合酶。
[0016]本申请人花费大量精力和经费，经过大量试错研究，尝试了无数种酶与dNTP类似物的排列组合，提供了一种优化的扩增目标核酸的方法，所述方法操作简单、性能卓越，尤其对于模板长度不定的由单端引物扩增的单链DNA产物有极其优越的产物得率和掺入率，在此基础上完成了本专利技术。
[0017]本专利技术一方面提供一种优化的扩增目标核酸的方法，包括下述步骤：
[0018]在反应体系中，以目标核酸分子为模板，加入引物，具有高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系，经扩增反应得到所述目标核酸的扩增产物。
[0019]其中所述高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系包括dNTP和DNA聚合酶；其中，所述dNTP是至少部分经标记分子修饰的dNTP，所述DNA聚合酶是具有3'
‑
5'外切酶活性的高保真聚合酶，所述复合体系用于进行的扩增是单链线性扩增。所述高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系能够高效掺入经修饰dNTP以获得高纯度的目标核酸扩增产物，解决3
’‑5’
外切酶活性高保真DNA聚合酶无法掺入经修饰dNTP的缺憾，有效生成高纯度、高保真的目标核酸扩增产物。随着所述高保真DNA聚合酶的修改优化，掺入效果好的经修饰dNTP种类也随之提高。
[0020]其中，所述DNA聚合酶——C端含有双链DNA结合结构域，即Sso7d；C端可以为Pfu/Deep Vent嵌合体；可以含V93Q突变。
[0021]其中，当DNA聚合酶含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内含有或不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；当DNA聚合酶不含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内不可有二键或三键等阻止分子旋转的结
构。
[0022]进一步地，当DNA聚合酶含V93Q突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系，其特征在于，所述高掺入率的dNTP
‑
DNA聚合酶复合体系包括dNTP和DNA聚合酶；所述dNTP是至少部分经标记分子修饰的dNTP，当DNA聚合酶含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内含有或不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；当DNA聚合酶不含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；所述DNA聚合酶是具有3
’‑5’
外切酶活性的高保真聚合酶。2.如权利要求1所述的复合体系，其特征在于，所述DNA聚合酶是Pfu，Deep Vent，KOD中的一种或多种；和/或，所述DNA聚合酶由Pfu，Deep Vent，KOD中的一种或多种经过改造得到；所述经标记分子修饰的dNTP是dATP，dCTP，dGTP中的一种或多种；当DNA聚合酶含V93Q突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内含有或不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；当DNA聚合酶不含V93Q突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；所述标记分子是生物素。3.如权利要求2所述的复合体系，其特征在于，所述含有生物素的修饰基团与所述dATP结合的位点是碱基的N6或7
‑
Deaza；优选的，当所述含有生物素的修饰基团与所述dATP结合的位点是碱基的N6时，所述经生物素修饰的dATP是biotin
‑7‑
dATP，或biotin
‑
14
‑
dATP，其结构式如下所示；当所述含有生物素的修饰基团与所述dATP结合的位点是碱基的7
‑
Deaza时，所述经生物素修饰的dATP是biotin
‑
11
‑
dATP，其结构式如下所示；
和/或，所述含有生物素的修饰基团与所述dCTP结合的位点是碱基的N4或C5；优选的，当所述含有生物素的修饰基团与所述dCTP结合的位点是碱基的N4时，所述经生物素修饰的dCTP是biotin
‑
14
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dCTP，其结构式如下所示；当所述含有生物素的修饰基团与所述dCTP结合的位点是碱基的C5时，所述经生物素修饰的dCTP是biotin
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11
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dCTP或biotin
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16
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，郭志伟，林国旻，车彬，余佳佳，李杰，
申请(专利权)人：上海羿鸣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：