用于全基因组扩增的单细胞工作流程制造技术

本文公开了用于开发单细胞全基因组DNA文库的涉及全基因组扩增的单细胞分析工作流程。所述单细胞分析工作流程涉及将细胞包封在单独的液滴中并使其在单独的液滴中裂解，然后在液滴内从染色质释放基因组DNA。转座酶接近释放的基因组DNA并将衔接子序列插入经切割的核酸片段中，从而生成跨全基因组的经标签片段化的基因组DNA片段。所述经标签片段化的DNA经历核酸扩增和测序，以生成单细胞全基因组DNA文库。库。库。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于全基因组扩增的单细胞工作流程
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求2020年3月20日提交的美国临时专利申请第62/992,772号的权益和优先权，该美国临时专利申请的全部公开内容据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
[0003]政府权利
[0004]本专利技术是在美国情报高级研究项目署(IARPA)授予的基金号：IAPRA
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BAA
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07(FELIX)的政府资助下完成的。美国政府对本专利技术拥有特定权利。

技术介绍

[0005]单细胞的全基因组分析仍然难以实现，因为常规方法时常导致次佳的测序覆盖度和/或低文库复杂度。例如，常规方法导致重复读段数高，并且映射读段的百分比低。这妨碍了对该全基因组的多个部分的有效分析。次佳的测序覆盖度可能遗漏检测整个全基因组中存在的一个或多个突变。此外，许多常规方法是涉及对板中的细胞执行全基因组扩增的低通量方法。因此，需要对各个细胞进行高通量的全基因组分析，这种分析不但实现测序覆盖度提高，还实现适当的文库复杂度。

技术实现思路

[0006]本公开整体涉及用于在单细胞工作流程分析中执行全基因组扩增的方法和设备。所公开的单细胞工作流程分析实现了对全基因组(例如，包括22对常染色体和1对性染色体的人类全基因组)的测序覆盖。一般来讲，单细胞工作流程涉及将各个细胞包封在液滴内并使其在液滴内裂解。使用蛋白酶从染色质释放基因组DNA(gDNA)。释放的基因组DNA经历标签片段化，其涉及切割衔接子序列并将其插入基因组DNA中。在各种实施方案中，标签片段化与基因组DNA释放同时发生。在各种实施方案中，标签片段化在基因组DNA释放之前发生。经标签片段化的DNA延伸，以填充由插入衔接子序列所产生的任何缺口。在各种实施方案中，基因组DNA的标签片段化发生于该基因组DNA在其中从染色质释放的同一液滴中。在各种实施方案中，标签片段化发生在第二液滴中。经标签片段化的DNA进一步经历核酸扩增。对所得的扩增子测序，以生成全基因组测序文库。
[0007]本文公开了一种用于执行全基因组测序的方法，该方法包括：在第一液滴内提供细胞和试剂，这些试剂包括裂解试剂和蛋白酶；在第一液滴内使用裂解试剂来裂解细胞；通过将第一液滴暴露于介于30℃与60℃之间的温度，在第一液滴内使用蛋白酶释放基因组DNA；通过以下方式在第一液滴或第二液滴中对释放的基因组DNA进行标签片段化：在介于35℃与55℃之间的温度下使用转座酶，切割释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到该释放的基因组DNA中，然后在介于40℃与100℃之间的温度下填充该释放的基因组DNA中由于结合衔接子序列而产生的一个或多个缺口；以及在第二液滴中扩增经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。
[0008]本文另外公开了一种用于执行全基因组测序的方法，该方法包括：将细胞和试剂包封在第一液滴内，这些试剂包括裂解试剂和蛋白酶；在第一液滴内使用裂解试剂来裂解
细胞；在第一液滴内使用蛋白酶释放基因组DNA；将释放的基因组DNA和反应混合物包封在第二液滴中，该反应混合物包含转座酶和DNA聚合酶；通过以下方式在第二液滴中对释放的基因组DNA进行标签片段化：使用转座酶，切割释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到该释放的基因组DNA中，使用DNA聚合酶，填充该释放的基因组DNA中由于结合衔接子序列而产生的一个或多个缺口；以及在第二液滴中扩增经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。
[0009]本文另外公开了一种用于执行全基因组测序的方法，该方法包括：将细胞和试剂包封在第一液滴内，这些试剂包括裂解试剂、蛋白酶，以及逆转录酶或DNA聚合酶两者中的任一者；在第一液滴内使用裂解试剂来裂解细胞；在第一液滴内使用蛋白酶释放基因组DNA；通过以下方式在第一液滴中对释放的基因组DNA进行标签片段化：使用转座酶，切割释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到该释放的基因组DNA中；使用逆转录酶或DNA聚合酶中的任一者，填充该释放的基因组DNA中由于结合衔接子序列而产生的一个或多个缺口；将经标签片段化的基因组DNA和反应混合物包封在第二液滴中；以及在第二液滴中，使用反应混合物扩增该经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。
[0010]在各种实施方案中，对释放的基因组DNA进行标签片段化发生在第一液滴内。在各种实施方案中，对释放的基因组DNA进行标签片段化发生在第二液滴内。在各种实施方案中，转座酶是MuA转座酶或Tn5转座酶。在各种实施方案中，转座酶是pA
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Tn5融合转座酶。在各种实施方案中，转座酶附接至衔接子序列。
[0011]在各种实施方案中，填充释放的基因组DNA中由于结合衔接子序列而产生的一个或多个缺口包括使用逆转录酶或DNA聚合酶中的任一者来填充所述一个或多个缺口。在各种实施方案中，DNA聚合酶是热启动DNA聚合酶。在各种实施方案中，DNA聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst)DNA聚合酶。在各种实施方案中，填充释放的基因组DNA中由于结合衔接子序列而产生的一个或多个缺口包括将释放的基因组DNA暴露于升高的温度。
[0012]在各种实施方案中，升高的温度为至少40℃。在各种实施方案中，升高的温度为至少50℃。在各种实施方案中，升高的温度为至少60℃。在各种实施方案中，使用逆转录酶填充一个或多个缺口，并且其中升高的温度介于40℃与50℃之间。在各种实施方案中，使用DNA聚合酶填充一个或多个缺口，并且其中升高的温度介于50℃与70℃之间。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于升高的温度并持续介于3分钟与8分钟之间的时间。
[0013]在各种实施方案中，本文所公开的方法还包括将释放的基因组DNA暴露于进一步升高的温度。在各种实施方案中，进一步升高的温度为至少70℃。在各种实施方案中，进一步升高的温度介于70℃与80℃之间。在各种实施方案中，进一步升高的温度为约72℃。在各种实施方案中，进一步升高的温度为至少75℃。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于进一步升高的温度并持续介于1分钟与20分钟之间的时间。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于进一步升高的温度并持续约10分钟。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于进一步升高的温度并持续介于40分钟与80分钟之间的时间。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于进一步升高的温度并持续约60分钟。
[0014]在各种实施方案中，本文所公开的方法还包括将释放的基因组DNA暴露于更进一步升高的温度。在各种实施方案中，更进一步升高的温度介于90℃与100℃之间。在各种实
施方案中，更进一步升高的温度为约95℃。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于更进一步升高的温度并持续介于1分钟与40分钟之间的时间。在各种实施方案中，将释放的基因组DNA暴露于更进一步升高的温度并持续约20分钟。在各种实施方案中，在第一液滴内使用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于执行全基因组测序的方法，所述方法包括：在第一液滴内提供细胞和试剂，所述试剂包括裂解试剂和蛋白酶；在所述第一液滴内使用所述裂解试剂来裂解所述细胞；通过将所述第一液滴暴露于介于30℃与60℃之间的温度，在所述第一液滴内使用所述蛋白酶释放基因组DNA；通过以下方式在所述第一液滴或第二液滴中对释放的基因组DNA进行标签片段化：在介于35℃与55℃之间的温度下使用转座酶，切割所述释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到所述释放的基因组DNA中；然后在介于40℃与100℃之间的温度下填充所述释放的基因组DNA中由于结合所述衔接子序列而产生的一个或多个缺口；以及在所述第二液滴中扩增经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。2.一种用于执行全基因组测序的方法，所述方法包括：将细胞和试剂包封在第一液滴内，所述试剂包括裂解试剂和蛋白酶；在所述第一液滴内使用所述裂解试剂来裂解所述细胞；在所述第一液滴内使用所述蛋白酶释放基因组DNA；将释放的基因组DNA和反应混合物包封在第二液滴中，所述反应混合物包含转座酶和DNA聚合酶；通过以下方式在所述第二液滴中对所述释放的基因组DNA进行标签片段化：使用所述转座酶，切割所述释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到所述释放的基因组DNA中；使用所述DNA聚合酶，填充所述释放的基因组DNA中由于结合所述衔接子序列而产生的一个或多个缺口；以及在所述第二液滴中扩增经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。3.一种用于执行全基因组测序的方法，所述方法包括：将细胞和试剂包封在第一液滴内，所述试剂包括裂解试剂、蛋白酶，以及逆转录酶或DNA聚合酶两者中的任一者；在所述第一液滴内使用所述裂解试剂来裂解所述细胞；在所述第一液滴内使用所述蛋白酶释放基因组DNA；通过以下方式在所述第一液滴中对释放的基因组DNA进行标签片段化：使用所述转座酶，切割所述释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到所述释放的基因组DNA中；使用所述逆转录酶或所述DNA聚合酶中的任一者，填充所述释放的基因组DNA中由于结合所述衔接子序列而产生的一个或多个缺口；将经标签片段化的基因组DNA和反应混合物包封在第二液滴中；以及在所述第二液滴中，使用所述反应混合物扩增所述经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。4.如权利要求1所述的方法，其中对所述释放的基因组DNA进行标签片段化发生在所述第一液滴内。5.如权利要求1所述的方法，其中对所述释放的基因组DNA进行标签片段化发生在所述
第二液滴内。6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述转座酶是MuA转座酶或Tn5转座酶。7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述转座酶是pA
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Tn5融合转座酶。8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述转座酶附接至所述衔接子序列。9.如权利要求1所述的方法，其中填充所述释放的基因组DNA中由于结合所述衔接子序列而产生的一个或多个缺口包括使用逆转录酶或DNA聚合酶中的任一者来填充所述一个或多个缺口。10.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶是热启动DNA聚合酶。11.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶。12.如权利要求2至11中任一项所述的方法，其中填充所述释放的基因组DNA中由于结合所述衔接子序列而产生的一个或多个缺口包括将所述释放的基因组DNA暴露于升高的温度。13.如权利要求12所述的方法，其中所述升高的温度为至少40℃。14.如权利要求12所述的方法，其中所述升高的温度为至少50℃。15.如权利要求12所述的方法，其中所述升高的温度为至少60℃。16.如权利要求12所述的方法，其中使用逆转录酶填充一个或多个缺口，并且其中所述升高的温度介于40℃与50℃之间。17.如权利要求12所述的方法，其中使用DNA聚合酶填充一个或多个缺口，并且其中所述升高的温度介于50℃与70℃之间。18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述升高的温度并持续介于3分钟与8分钟之间的时间。19.如权利要求12至18中任一项所述的方法，其还包括将所述释放的基因组DNA暴露于进一步升高的温度。20.如权利要求19所述的方法，其中所述进一步升高的温度为至少70℃。21.如权利要求19所述的方法，其中所述进一步升高的温度介于70℃与80℃之间。22.如权利要求19所述的方法，其中所述进一步升高的温度为约72℃。23.如权利要求19所述的方法，其中所述进一步升高的温度为至少75℃。24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述进一步升高的温度并持续介于1分钟与20分钟之间的时间。25.如权利要求24所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述进一步升高的温度并持续约10分钟。26.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述进一步升高的温度并持续介于40分钟与80分钟之间的时间。27.如权利要求26所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述进一步升高的温度并持续约60分钟。28.如权利要求19至27中任一项所述的方法，其还包括将所述释放的基因组DNA暴露于更进一步升高的温度。29.如权利要求28所述的方法，其中所述更进一步升高的温度介于90℃与100℃之间。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述更进一步升高的温度为约95℃。31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述更进一步升高的温度并持续介于1分钟与40分钟之间的时间。32.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中将所述释放的基因组DNA暴露于所述更进一步升高的温度并持续约20分钟。33.如权利要求2至32中任一项所述的方法，其中在所述第一液滴内使用所述蛋白酶释放基因组DNA包括将所述第一液滴暴露于介于35℃与55℃之间的温度。34.如权利要求2至33中任一项所述的方法，其中在所述第一液滴内使用所述蛋白酶释放基因组DNA包括将所述第一液滴暴露于约50℃的温度。35.如权利要求1或3所述的方法，其中释放所述基因组DNA与切割所述释放的基因组DNA并结合衔接子序列并行发生。36.如权利要求35所述的方法，其中释放所述基因组DNA与切割所述释放的基因组DNA并结合衔接子序列包括：将所述第一液滴暴露于介于35℃与55℃之间的第一温度并持续介于20分钟与80分钟之间的时间；以及将所述第一液滴暴露于介于45℃与70℃之间的第二温度并持续介于1分钟与10分钟之间的时间。37.如权利要求36所述的方法，其中释放所述基因组DNA与切割所述释放的基因组DNA并结合衔接子序列包括：将所述第一液滴暴露于约37℃的第一温度并持续约30分钟；以及将所述第一液滴暴露于约65℃的第二温度并持续约5分钟。38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中扩增所述经标签片段化的基因组DNA发生在对所述释放的基因组DNA进行标签片段化之后。39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中扩增所述经标签片段化的基因组DNA包括执行变性、退火和核酸延伸的一个或多个循环。40.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中扩增所述经标签片段化的基因组DNA包括执行等温核酸扩增反应。41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述裂解试剂是NP40。42.如权利要求38所述的方法，其中所述裂解试剂是10％NP40。43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶是蛋白酶K。44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中使用所述反应混合物扩增所述经标签片段化的基因组DNA以生成全基因组扩增子包括将细胞条形码结合到所述全基因组扩增子中。45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其还包括对所述全基因组扩增子进行测序。46.如权利要求45所述的方法，其还包括使用经测序的全基因组扩增子生成全基因组测序文库。47.如权利要求46所述的方法，其中映射所述全基因组测序文库的至少20％的序列读段。
48.如权利要求46所述的方法，其中映射所述全基因组测序文库的至少50％的序列读段。49.如权利要求46所述的方法，其中映射所述全基因组测序文库的至少80％的序列读段。50.如权利要求46所述的方法，其中所述全基因组测序文库的至少10％的序列读段具有正确的结构。51.如权利要求46所述的方法，其中所述全基因组测序文库的至少50％的序列读段具有正确的结构。52.如权利要求46所述的方法，其中所述全基因组测序文库的至少80％的序列具有正确的结构。53.一种用于执行全基因组测序的系统，所述系统包括：被配置为执行多个步骤的装置，所述步骤包括：在第一液滴内提供细胞和试剂，所述试剂包括裂解试剂和蛋白酶；在所述第一液滴内使用所述裂解试剂来裂解所述细胞；通过将所述第一液滴暴露于介于30℃与60℃之间的温度，在所述第一液滴内使用所述蛋白酶释放基因组DNA；通过以下方式在所述第一液滴或第二液滴中对释放的基因组DNA进行标签片段化：在介于35℃与55℃之间的温度下使用转座酶，切割所述释放的基因组DNA并将衔接子序列结合到所述释放的基因组DNA中；然后在介于40℃与100℃之间的温度下填充所述释放的基因组DNA中由于结合所述衔接子序列而产生的一个或多个缺口；以及在所述第二液滴中扩增经标签片段化的基因组DNA，以生成全基因组扩增子。54.一种用于执行全基因组测序的系...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：使命生物公司，
类型：发明
国别省市：