核酸检测和引物设计方法技术

本文提供了用于检测来自单细胞的靶核酸的方法。所述方法的优选实施方案包括在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列通常与细胞中的细胞DNA和RNA互补，所述细胞DNA包括基因组DNA。提供细胞样品，并且在优选实施方案中，所述样品来自单细胞。所述细胞被裂解，并且在单一反应中，可以检测DNA和RNA两者，而无需对所述样品进行细分。这可以通过提供与一种或多种靶核酸互补的核酸扩增引物组，特别是在扩增反应中选择性扩增特定靶核酸或扩增子的引物组来实现。还提供了用于这些方法的引物设计方法以及用于执行所述方法的设备和系统。所述方法的设备和系统。所述方法的设备和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸检测和引物设计方法


[0001]本专利技术整体涉及检测细胞或生物体中的靶基因或核酸，更具体地涉及从单细胞中的一种或多种靶核酸中检测并识别DNA和RNA两者。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求D.Dhingra和D.Ruff于2019年1月22日提交的题为“Method,Systems and Apparatus for DNA and RNA Primer Design”的美国临时申请USSN 62/795,171的优先权。

技术介绍

[0004]基于核酸核苷酸序列互补性的核酸分析方法可以直接分析遗传性状。因此，这些方法是识别遗传疾病、识别和监测癌症、微生物等的非常有力的手段。
[0005]当需要分析包含细胞DNA(包括基因组、染色体外、病毒和线粒体DNA)和RNA的多种靶核酸时，检测以极少量存在于样品中的靶基因或核酸(例如来自单细胞)是困难的并且变得甚至更成问题。
[0006]需要提供结合了与靶向DNA测序组合的靶向RNA测序的高通量单细胞核酸测序的方法、系统和设备。本文描述的专利技术满足了这些未解决的挑战和需求。

技术实现思路

[0007]本文描述和要求保护的专利技术具有多个属性和实施方案，包括但不限于在本
技术实现思路
中阐述或描述或引用的那些属性和实施方案。本文描述和要求保护的专利技术不限于本
技术实现思路
中识别的特征或实施方案，或受这些特征或实施方案的限制，这些特征或实施方案仅出于说明而非限制的目的包括在内。
[0008]在一方面，所公开的实施方案通常结合了与靶向DNA测序组合的靶向RNA测序。某些实施方案向单细胞测序工作流程提供基本上组合的靶向RNA测序和靶向DNA测序。在一个实施方案中，该方法基本上不需要将样品分成RNA和DNA部分。扩增产物(扩增子)在基因组与转录组之间可能有重叠覆盖。一些实施方案部分地通过选择具有特定序列或引物修饰的引物来提供选择性扩增DNA或RNA扩增子的方法。DNA和RNA扩增子也可以通过测序来区分并平衡每个扩增子的最佳测序深度。
[0009]在另一方面，提供了设计并提供用于选择性或优先扩增DNA或RNA扩增子的引物的方法。扩增引物还可以在骨架、核苷酸或其他地方包含基于序列或靶核酸类型(例如mRNA或gDNA)而影响(例如减少、阻止或限制)特定扩增子的扩增的化学修饰。
[0010]例如，在一些实施方案中，设计并提供引物，其中DNA反向引物被阻断以便在PCR之前不延伸。在其他实施方案中，DNA反向引物和正向引物被阻断。在其他实施方案中，扩增反应使DNA反向引物和正向引物被阻断，以便在PCR之前不延伸。
[0011]某些实施方案利用具有替代化学性质的固体珠粒，其中用于DNA和RNA两者的正向引物均在溶液中。在这些实施方案中，正向引物含有嵌入的PCR退火序列或
‘
柄(handle)
’
，
其允许与引物杂交。柄是靶序列上游5
’
的特定尾部。此柄与珠粒条形码寡核苷酸互补，并充当PCR延伸桥，以将靶扩增子连接到珠粒条形码文库引物序列。固体珠包含可以与正向引物上的PCR柄退火的引物。基因特异性RNA反向引物和基因特异性DNA反向引物在溶液中。RNA反向引物可用于逆转录。在特定的实施方案中，DNA反向引物被阻断以便在PCR之前不延伸。本文描述的方法在可以产生的唯一核酸标记的数量方面实际上是不受限制的。
[0012]示例性实施方案的工作流程涉及在仪器上装载细胞以释放基因组DNA和RNA(核酸)。然后将释放的核酸引入配置用于逆转录和PCR的试剂中。在一个实施方案中，固体珠粒可用于此目的。在这里，珠粒装载有待用于DNA和RNA两者的正向引物，其中所有反向引物均在溶液中
‑
基因特异性RNA反向引物和基因特异性DNA反向引物。RNA反向引物可用于逆转录。本文所描述的方法的高通量性质允许对数千到数百万个单细胞执行DNA和RNA的多组学分析，从而提供了一种可扩展的方法来表征大量单细胞的核酸。
[0013]在另一方面，提供了用于检测来自单细胞的靶核酸的方法。一个非限制性的代表性实施方案独立于所呈现的顺序包括多个或所有以下步骤：在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中靶核酸序列与细胞中的核酸互补；提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；将包封的细胞与液滴中的蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；提供一个或多个核酸扩增引物组，其中每个引物组与靶核酸互补并且核酸扩增引物组的至少一个引物包括条形码识别序列；执行核酸扩增反应以从单细胞的核酸形成扩增产物，其中扩增产物包括一个或多个靶核酸序列的扩增子；提供包括与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的扩增产物在足以使亲和试剂与靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触；以及通过对第一条码和第二条码进行测序来确定靶核酸的身份。
[0014]靶核酸通常是DNA或RNA。在一些实施方案中，扩增产物由DNA和RNA靶核酸序列两者产生。
[0015]某些实施方案包括添加逆转录酶聚合酶并包括从RNA靶序列产生cDNA的步骤，在此步骤中，检测并识别来自单细胞的mRNA靶核酸。
[0016]在另一实施方案中，所提供的每个引物组包括与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。
[0017]在另一实施方案中，引物组的正向引物包括识别条形码序列。
[0018]在一个实施方案中，所提供的一个或多个核酸扩增引物组包含在添加逆转录酶之前被阻断的DNA特异性引物。此实施方案的一种实施方式包括提供在任何逆转录酶活性期间被阻断的DNA反向引物，使得仅通过RNA反向引物产生cDNA。在另一实施方式中，提供在RNA反向引物之外的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。
[0019]在一个实施方案中，靶核酸可以包括DNA和RNA两者，并且选择性扩增DNA或RNA以形成对DNA或RNA靶核酸具有特异性的扩增子产物。
[0020]在一个实施方案中，DNA或RNA扩增子在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的竞争物而被衰减、限制或阻止。
[0021]在另一实施方案中，DNA或RNA扩增子在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩
增子的生物素化引物而被衰减、限制或阻止。
[0022]在另一实施方案中，为RNA扩增而提供的扩增引物的一部分包含尿嘧啶并且能够通过裂解而去除RNA扩增子。
[0023]在另一个实施方案中，独立于所呈现的顺序，用于检测来自单细胞的靶核酸的方法包括以下步骤：在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中靶核酸序列与细胞中的基因组DNA和RNA互补；提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测来自单细胞的靶核酸的方法，所述方法独立于所呈现的顺序包括以下步骤：i)在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列与细胞中的核酸互补；ii)提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；iii)将经包封的细胞与液滴中的所述蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；iv)提供一个或多个核酸扩增引物组，其中每个引物组与靶核酸互补并且核酸扩增引物组的至少一个引物包含条形码识别序列；v)执行核酸扩增反应以从单细胞的所述核酸形成扩增产物，所述扩增产物包含一个或多个靶核酸序列的扩增子；vi)提供包含与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与所述识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；vii)使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的所述扩增产物在足以使所述亲和试剂与所述靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触；以及viii)通过对第一条码和第二条码进行测序来确定所述靶核酸的身份。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA或RNA。3.根据权利要求1所述的方法，其中DNA和RNA扩增产物均由所述靶核酸序列产生。4.根据权利要求1所述的方法，其包括添加逆转录酶聚合酶并包括从RNA靶序列产生cDNA的步骤，在此步骤中，检测并识别来自单细胞的RNA靶核酸。5.根据权利要求4所述的方法，其中所提供的所述一个或多个核酸扩增引物组包含在添加逆转录酶之前被阻断的DNA特异性引物。6.根据权利要求5所述的方法，其包括提供在任何逆转录酶活性期间被阻断的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。7.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述RNA反向引物之外的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸可以包括DNA和RNA两者，并且选择性扩增DNA或RNA以形成对DNA或RNA靶核酸具有特异性的扩增子产物。9.根据权利要求1所述的方法，其中在形成细胞裂解物之后通过加热使步骤iii)中的所述蛋白酶失活。10.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增期间通过使用选择性调节DNA或RNA扩增子扩增的竞争物来衰减、限制或阻止DNA或RNA扩增子。11.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的生物素化引物来衰减、限制或阻止DNA或RNA扩增子。12.根据权利要求1所述的方法，其中为RNA扩增而提供的文库引...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：使命生物公司，
类型：发明
国别省市：