一种耐热的高效率逆转录酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物诊断领域，具体涉及一种耐热、高效率、抗抑制逆转录酶突变体。本发明专利技术公开了一种耐热的高效率逆转录酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术逆转录酶为改良的M

【技术实现步骤摘要】
一种耐热的高效率逆转录酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物诊断领域，具体涉及一种耐热、高效率、抗抑制逆转录酶突变体。

技术介绍

[0002]逆转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的DNA聚合酶，具有三种酶活性的多功能酶，包括RNA和DNA依赖性的DNA聚合酶活性，以及催化RNA
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DNA杂合链中RNA降解的RNase H活性。在生物医学领域，逆转录酶被广泛用于病毒RNA检测、基因表达与功能分析、cDNA文库制备、RNA测序、微阵列分析、RACE等等方面，是应用最为广泛的生物医药工具酶之一。
[0003]目前，逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒(AvianMyeloblastosis Virus,AMV)或莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia virus,M
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MLV)。AMV逆转录酶是异源二聚体，热稳定性较好，但具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，因此产率较低，通常只能产生较短的cDNA片段(<5kb)。而M
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MLV逆转录酶是一种单体结构酶，生产与改造更为方便，其反应温度约为37℃。虽然M
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MLV的热稳定性低于AMV逆转录酶，但其RNA酶H活性较低，因此具有更高的长cDNA(<7kb)合成效率。使用M
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MLV逆转录酶仍是市场的主流方向。
[0004]野生型M
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>MLV逆转录酶最适反应温度为37℃，在此温度下单链RNA容易自身配对形成发夹等复杂二级结构，阻碍逆转录反应的进行；这个问题可以通过在较高温度下进行cDNA合成来克服，但野生型逆转录酶的热稳定性较差，H
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MMLV逆转录酶热稳定性虽有一定的提高，但还不足以完全克服热稳定性问题，这对酶的热稳定性就提出了更高的要求；同时现在核酸直扩已是本领域突破的方向之一，但未纯化样本中带有各种物质，常常会抑制M
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MLV逆转录酶活性。
[0005]目前逆转录试剂的最主要产品为美国Invitrogen公司(已被ThermoFisher收购)的SuperScript系列产品，占领了国内半数以上的市场。由于进口试剂价格昂贵，市场仍缺乏成本低、性能优良的国产逆转录试剂；所以开发一种热稳定性高、合成性能好、抑制剂耐受性能好的逆转录酶突变体十分重要

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种热稳定性高、合成性能好、抑制剂耐受性好的逆转录酶。
[0007]本专利技术公开了一种耐热的高效率逆转录酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步，本专利技术提供一种编码逆转录酶的核苷酸序列，所述核苷酸序编码的逆转录酶序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]进一步，本专利技术提供一种重组表达载体，所述载体包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0010]进一步，本专利技术提供一种重组宿主菌，所述宿主菌包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的重组表达载体。
[0011]进一步，本专利技术提供一种逆转录反应试剂盒，其包含高效率逆转录酶突变体和逆转录反应缓冲液。
[0012]进一步，本专利技术提供一种兼容性好的逆转录反应缓冲液，所述反应缓冲液主要包括：50
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300mM Tirs
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HCl，50
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200mM(NH4)2SO4，2
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10mM MgCl2，0.5
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1mM dNTPs，0.1
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2.5μMOligod(T)
20
/随机引物，1
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5mM DTT。优选地，所述反应缓冲液的组成成分为：150mM Tirs
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HCl，50mM(NH4)2SO4，6mM MgCl2，0.5mM dNTPs，2.5μM Oligod(T)
20
/随机引物，2mM DTT。
[0013]本专利技术的反应缓冲液可维持反应的最佳pH和离子强度，并含有提高逆转录效率和后续PCR反应效率的添加剂。其中Tirs
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HCl可以提供pH6.0
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9.0稳定的缓冲环境；(NH4)2SO4属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，能形成高盐环境，在反应过程中最大程度的保护酶活性；MgCl2能增加逆转录酶和DNA聚合酶的活性；dNTPs通常为0.5
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1mM，最好为等摩尔浓度，推荐使用新鲜稀释的高品质dNTP，以确保良好的逆转录；DTT为一种还原剂，通常用于提供最佳的酶活性。
[0014]进一步，本专利技术提供一种一步法RT
‑
PCR检测试剂盒，其包括本专利技术所述包含高效率逆转录酶突变体。
[0015]进一步，本专利技术提供所述包含高效率逆转录酶突变体在制备分子生物学试剂中用途。
[0016]此外，本专利技术进一步提供一种优化的RNA病毒的RT
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PCR检测方法，具体方法包括：
[0017](1)RNA样本采样：
[0018]粗处理的RNA样本：采用病毒保存液(天罗诊断，货号TS
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SA
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20200604
‑
A)来处理咽拭子样本，具体操作为用咽拭子采集样本后，将拭子头浸入500μl的病毒保存液中，震荡混匀备用；
[0019](2)反应体系配制：
[0020]注意：RNA检测用的引物/探针浓度请以终浓度0.1
‑
1.0μM作为设定范围的参考，扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
[0021](3)RT
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PCR扩增：
[0022]将配制好的反应体系放置在PCR仪中，按如下程序进行扩增反应。
[0023]本专利技术逆转录酶为改良的M
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MLV逆转录酶，具有高持续合成能力和高耐热性，生成完整cDNA所需时间更短，可对极少量RNA模板进行良好的逆转录反应；抗抑制能力强，可采用直接样品采集液，无需进行下RNA纯化，cDNA也能合成，具有广泛的应用前景和市场推广价值。
附图说明
[0024]图1为MMLVwt和部分突变体纯化SDS
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PAGE图。
[0025]图2为MMLVwt和突变体M106的RT
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qPCR扩增曲线。
[0026]图3为突变体M106在不同温度下的RT
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qPCR扩增曲线。
[0027]图4为MMLVwt、M106和SuperScript
TM IV一步法RT
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qPCR体系ORF基因直扩。
[0028]图5为MMLVwt、M106和SuperScr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐热的高效率逆转录酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示逆转录酶的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。5.一种重组宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的重组表达载体。6.一种逆转录反应试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述高效率逆转录酶突变体和逆转录反应缓冲液。7.如权利要求6所述的逆转录反应试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：50
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300mM Tirs
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HCl，50
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200mM(NH4)2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继国，李振海，陈普，
申请(专利权)人：天筛上海科技有限公司，
类型：发明
国别省市：