【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，更具体地涉及一种滴瓶式荧光pcr试剂盒及其使用方法。
技术介绍
1、荧光定量pcr是一种有用的检测方法，已广泛用于食品、环境、临床样本的快速检测，尤其是传染病快检方面；pcr核酸检测标准操作程序大体为样本采集、运送、核酸提取、pcr检测，此外对于一些传染病病毒，相关规范要求对原始样本在进行核酸提取前进行可靠的灭活，因此流程复杂且试剂成分多，严重依赖标准pcr实验室及专业操作人员，同时也产生了大量仪器耗材成本、人力成本、污染风险成本，给大规模筛查及快速灵活的应用场景造成了巨大障碍。
2、为了解决核酸检测流程简单，不依赖专业人员问题，国内外主要两种技术路线，美国赛沛、雅培，cue health及中国万孚、尤思达、杭州遂真及上海奥染等厂家主要卡盒式一体机路线，但是这种技术路线设备、卡盒成本过高，难于大规模筛查应用。另外卡尤迪及圣湘采用免提取的“一步法”路线，虽然节省了提取成本，但是依然需要多步移液和分液进行，还是依赖于专业人员和存在样本污染风险。
3、目前，全球急需适合于大规模筛查、无需依赖专业人员的荧光定量pcr 产品。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种适合于大规模筛查、无需依赖专业人员的荧光定量pcr产品，满足“操作非常简单”和“成本非常低廉”两个核心指标。
2、本专利技术公开了一种滴瓶式荧光pcr试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶，其特征在于所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为 0.5mm～1.5mm；
3、本专利技术技术方案采取滴瓶代替精准的移液加样，使得样本液滴和n×荧光 pcr反应液的液滴体积一致非常重要，能最大降低反应体系的误差。液滴大小控制主要采取如下策略：1：保证滴嘴大小孔径一致可让液滴大小接近，本专利技术中优先选用的采样滴瓶和反应液滴瓶的规格一致来保证液滴大小一致。在某些多管混合实施例中，采样滴瓶规格虽然不一致时采用同样孔径的滴嘴一致行保证了液滴大小的接近；2：本专利技术在一些实施案例过程中，经过测量发现反应液滴瓶滴出溶液25ul-30ul/滴，而采用te缓冲液作为采样液的采样瓶滴出的溶液35-40ul。为了样本液滴的大小，本专利技术人发现采用0.5％-10％表面活性剂，可以通过加大表面张力，调节液滴大小，保证样本液滴和荧光 pcr反应液的液滴体积大体一致。
4、在一优选实施例中，所述采样滴瓶和反应液滴瓶均包括瓶体、滴嘴及滴嘴盖，更优选所述瓶体的瓶口上有可撕拆的密封薄膜或铝箔膜，保证运输过程中放置液体溢出。
5、在一优选实施例中，所述采样滴瓶的滴嘴内含有滤纸或滤芯，以便于过滤掉实际采样带入到颗粒杂质。
6、在一优选实施例中，dna病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mm tris hcl ph7.0-8.5，0.5-3mm edta，0.5-10％的表面活性剂。
7、在一优选实施例中，rna病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mm tris hcl ph7.0-8.5，0.5-3mm rnase抑制剂，0.5-10％的表面活性剂；所述rnase 抑制剂包括蛋白类rnase抑制及化学rnase抑制剂，优选低成本的化学rnase 抑制剂如聚乙烯磺酸钠(pvsa)等。
8、所述表面活性剂，包括triton x 100，np-40，吐温20，吐温80或聚乙二醇等。
9、在一优选实施例中，所述采样液包含如下组分：
10、tris hcl ph 7.0-8.5，5-20mm；
11、tritonx-100，0.5％v/v-5％v/v；
12、聚乙烯磺酸钠，0.05mg/ml-50mg/ml；
13、dtt，0.1-0.5mm。
14、在一些优选实施例中，dna样本检测和单酶一步法rna检测中，荧光pcr 反应液含有pcr酶，ung酶，氯化镁，dntps，dutp，pcr缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的pcr预混液及目标基因的引物探针混合液。更优选实施例，将荧光pcr反应液和目标基因引物探针混合液分装在a和b两个滴瓶中，使用前将a滴瓶的荧光pcr反应液直接滴入b滴瓶目标基因引物探针混合液快速制备成反应滴瓶。
15、在一些优选实施例中，双酶一步法rna检测的实施例中，所述荧光pcr 反应液含有pcr酶，ung酶，氯化镁，dntps，dutp，pcr缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的pcr预混液。
16、所述的荧光pcr酶为野生及改造的tth dna聚合酶，taq dna聚合酶或 mmlv聚合酶的一种或两种，具有抗抑制特征适用于直接荧光pcr扩增。
17、在一些优选实施例中，所述荧光pcr反应液为toroivdr 5g qpcr premix withung。
18、在一些优选实施例中，还包含所述pcr反应管，管中含有逆转录酶、rnase 抑制剂及目标基因引物探针混合物，混合物为冻干制剂形式。
19、另外一方面，本专利技术还公开上述滴瓶式荧光pcr试剂盒的使用方法，包括下列步骤：
20、s1：样本采集：环境拭子，口咽拭子，鼻拭子，环境拭子，肛门拭子及阴道拭子等拭子类样本，采集后直接放入及折断到采样滴瓶，挤压释放。血清，全血类及尿液等液体类直接按和采样液比例1％-20％加入到采样滴瓶。粪便，动植物组织等固体类样本，从采样瓶里取600-1ml采样液研磨并离心后，取上清完全转入采样滴瓶里。
21、s2：将采样滴瓶里的样本上下混合后滴入反应管1滴，然后再将反应液滴瓶中荧光pcr反应液上下混合后滴入一滴到反应管；手指轻弹混合直接放入荧光pcr仪进行实时荧光pcr检测。
22、本专利技术滴瓶式荧光pcr试剂盒具有如下有益效果:
23、操作过程非常简单，只需样本和试剂两个滴加动作，适合非专业人员使用。没有吸液和移液过程，来降低吸取过程的气溶胶污染，适合非专业实验室场景使用。
24、制造成本低，所有滴瓶均采用非常通用的抗原检测采样用的滴瓶，及反应管采用市场通用的定量pcr单管及八连管，通用性高，价格非常低廉。试剂采用市场大量生产的pcr试剂原料，成本也非常低廉。
25、使用成本低，所有过程无需移液器及移液吸头，离心机，温浴设备，加热设备等所有仪器设备，无需专业实验室。降低了人工成本和实验室效果。
26、降低了污染风险，彻底排除了移液器或滴管液体吸取分装及配制过程的气溶胶污染。
27、灵敏度及准确度高，采用金标准pcr检测技术，因每液滴大小25-30ul，大大提高了加样体积，可实现50-200copies/ml的超灵敏检测。
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1.一种滴瓶式荧光PCR试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶，其特征在于，所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为0.5mm～1.5mm；所述采样滴瓶含有采样液，所述反应液滴瓶包含荧光PCR反应液；其中所述采样液含有5-20mM Tris-HCl pH 7.0-8.5；0.5％v/v-10％v/v。
2.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述采样滴瓶和反应液滴瓶均包括瓶体、滴嘴及滴嘴盖，所述瓶体的瓶口上有可撕拆的密封薄膜或铝箔膜。
3.如权利要求2所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述采样滴瓶的滴嘴内含有滤纸或滤芯。
4.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，DNA病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mM Tris-HCL pH 7.0-8.5，0.5-3mM EDTA，0.5-10％的表面活性剂。
5.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，RNA病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mM Tris-HCL pH 7.0-8.5，0.5-3mM RNase抑制剂，
6.如权利要求5所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为TritonX 100，NP-40，吐温20，吐温80或聚乙二醇中之一。
7.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述采样液包含如下组分：
8.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液为TOROIVDR 5G qPCR Premix with UNG。
9.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述滴瓶式荧光PCR试剂盒还含管PCR反应管。
10.权利要求1-9中任一项所述滴瓶式荧光PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下列步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种滴瓶式荧光pcr试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶，其特征在于，所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为0.5mm～1.5mm；所述采样滴瓶含有采样液，所述反应液滴瓶包含荧光pcr反应液；其中所述采样液含有5-20mm tris-hcl ph 7.0-8.5；0.5％v/v-10％v/v。
2.如权利要求1所述的滴瓶式荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述采样滴瓶和反应液滴瓶均包括瓶体、滴嘴及滴嘴盖，所述瓶体的瓶口上有可撕拆的密封薄膜或铝箔膜。
3.如权利要求2所述的滴瓶式荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述采样滴瓶的滴嘴内含有滤纸或滤芯。
4.如权利要求1所述的滴瓶式荧光pcr试剂盒，其特征在于，dna病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mm tris-hcl ph 7.0-8.5，0.5-3mm edta，0.5-10％的表面活性剂。
5.如权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王继国，张帆，李汉昕，潘国靖，陈普，李振海，
申请(专利权)人：天筛上海科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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