单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物；对线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物；其中，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；对接头连接产物进行文库扩增、测序和生信分析，获得DNA分子断点信息。本发明专利技术还公开了用于片段化DNA分子断点信息检测的试剂盒/试剂。本发明专利技术通过单引物扩增建库技术极好的实现了靶向检测DNA分子断点的功能。同时验证该断点信息与样本来源有关，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。源的潜在功能。源的潜在功能。

Application and kit of single primer amplification library building technology in detecting molecular breakpoint information of fragmented DNA

【技术实现步骤摘要】
单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，涉及单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来使用下一代测序(NGS)技术的研究发现，游离DNA分子的天然断点位置信息可作为分子标志物，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。但是目前的研究都是基于全基因组游离DNA深度测序的断点分析；此类方法存在测序成本极高和游离DNA分子建库效率低而导致的高噪声问题，导致此类的研究进展缓慢，临床转化研究难以进行。为了降低检测成本，理想的分子断点检测技术应聚焦在目标区域实现，避免大量无关区域高深度测序对成本和分析时间的浪费。为了提高分子断点的检测精度，更应选用高转化效率的游离DNA分子建库方法，来提高目标区域的文库分子数量，从而提升检测精度，降低噪声。
[0003]现有的两类可对游离DNA分子的靶向建库技术，多重PCR技术和杂交捕获技术均无法满足这样的要求。PCR技术无法检测未知断点，而杂交捕获技术存在文库建库效率低和靶向探针结合偏好性的问题，也无法有效的检测目标区域的游离DNA分子的断点信息。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术存在的上述缺点，本专利技术的目的在于提供一种单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒。本专利技术通过单引物扩增建库技术极好的实现了靶向检测DNA分子断点的功能。同时验证该断点信息与样本来源有关，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。
[0005]本专利技术提供的单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，所述单引物扩增建库技术主要步骤为：1.特异性引物对片段化DNA分子的目标区域进行线性扩增，此扩增保留了片段化DNA分子一端的断点信息；2.线性扩增产物通过单链连接酶与单链接头相连，构建成单链文库分子；3.此文库分子通过后续的文库扩增，用于NGS测序分析；4.NGS测序数据通过参考基因组比对和去重分析，还原得到每个片段化DNA分子一端的断点位置，对目标区域的所有片段化DNA分子一端的断点信息进行数据处理得到的该目标区域不同断点的频率分布。最终，本专利技术通过不同来源的样本测试(例如健康人血浆与尿液的游离DNA样本以及血细胞基因组DNA使用酶切打断后片段化DNA样本)，证实该频率分布与样本来源高度相关，提示以此方法检测到的DNA分子断点具有用于预测分子组织来源的潜在功能。
[0006]本专利技术提供的单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物；(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物；其中，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；(3)对步骤(2)所得的接头连接产物进行文库扩
增、测序和生信分析，获得DNA分子断点信息。
[0007]本专利技术应用中，特异性引物的核苷酸序列包括如编号SEQ ID No.1
‑
11所示序列之一种或多种的组合，为可用于线性扩增的特异性引物。
[0008]本专利技术应用中，所述片段化DNA分子的长度为25～500bp/nt，优选为50～200bp/nt；
[0009]和/或，所述片段化DNA分子的结构为双链DNA、单链DNA或cDNA；
[0010]和/或，所述片段化DNA分子为游离DNA；
[0011]和/或，所述片段化DNA分子来源于体液，优选来源于血液和/或尿液；
[0012]和/或，所述片段化DNA分子由基因组DNA经打断制备获得，优选为超声打断和/或酶切打断。
[0013]本专利技术应用中，还包括：纯化线性扩增产物，优选的，所述纯化的方法为针对dNTP标记分子的亲和纯化；和/或，至少部分的所述dNTP偶联有标记分子，所述标记分子优选为生物素。
[0014]在具体实施方案中，本专利技术应用中，对目标区域进行线性扩增1
‑
100轮，进一步优选1
‑
60轮，再优选20
‑
40轮。
[0015]本专利技术应用中，所述特异性引物的3
’
端至少部分的序列与目标区域互补，与目标区域互补的序列的长度≥16nt；
[0016]和/或，所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有封闭基团修饰，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团，取代了所述特异性引物的3
’
末端核苷酸的3位C原子羟基；
[0017]和/或，所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合。
[0018]本专利技术应用中，所述线性扩增的扩增体系中包括特异性引物、DNA聚合酶和dNTP，优选的，所述DNA聚合酶具有3
’‑5’
外切酶活性，更优选的，所述DNA聚合酶选自B族DNA聚合酶。
[0019]本专利技术应用中，所述DNA聚合酶如B族DNA聚合酶，其主要用途是切除所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有的封闭基团。
[0020]本专利技术应用中，所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合；
[0021]所述单链连接酶为T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶；
[0022]所述单链接头的5
’
末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构；优选的，单链接头的5
’
末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团；
[0023]所述单链接头的3
’
末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团；
[0024]所述单链接头的5
’
端区域为具有黏性末端的部分双链结构。
[0025]在具体实施方案中，本专利技术应用中，在线性扩增和接头连接后，还需要进行预扩增和扩库步骤以构建完整的文库分子，用于测序。
[0026]本专利技术还包括利用单引物扩增建库技术所得连接产物在构建文库中的应用。本专利技术在文库构建中的应用，包括：通过连接产物构建文库。
[0027]本专利技术应用中，所述文库扩增的构建方法包括：将连接产物进行预扩增，以提供预
扩增产物，所述的预扩增引物的前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合，所述的预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列；
[0028]还包括：将预扩增产物进行扩库，以提供文库产物，所述的扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列，所述的扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
[0029]本专利技术还包括单引物扩增建库技术在片段化DNA分子断点信息目标区域测序中的应用，包括：通过上述所提供的文库产物进行测序，以提供片段化DNA分子断点信息目标区域的测序结果。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，其特征在于，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物；(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物；其中，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；(3)对步骤(2)所得的接头连接产物进行文库扩增、测序和生信分析，获得DNA分子断点信息。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述片段化DNA分子的长度为25～500bp/nt，优选为50～200bp/nt；和/或，所述片段化DNA分子的结构为双链DNA、单链DNA或cDNA；和/或，所述片段化DNA分子为游离DNA；和/或，所述片段化DNA分子来源于体液，优选来源于血液和/或尿液；和/或，所述片段化DNA分子由基因组DNA经打断制备获得，优选为超声打断和/或酶切打断。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性引物的3
’
端至少部分的序列与目标区域互补，与目标区域互补的序列的长度≥16nt；和/或，所述特异性引物的3
’
末端核苷酸含有封闭基团修饰，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团，取代了所述特异性引物的3
’
末端核苷酸的3位C原子羟基；和/或，所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述线性扩增的扩增体系中包括特异性引物、DNA聚合酶和dNTP，优选的，所述DNA聚合酶具有3
’‑5’
外切酶活性，更优选的，所述DNA聚合酶选自B族DNA聚合酶。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合；所述单链连接酶为T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶；所述单链接头的5

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，
申请(专利权)人：上海羿鸣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：