一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法，包括SMN1

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别涉及一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法。

技术介绍

[0002]SMA的主要致病基因位于5号染色体5q11.2
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13.3区域,该区域整体呈现为一个巨大的反向重复结构，区域内结构复杂,从而导致该区域内容易发生非等位基因间同源重组，造成基因缺失或重复等异常。研究发现，SMN基因存在两个高度同源的基因被命名为运动神经元存活基因(survival motor neuron,SMN)，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2，而SMN1基因的缺失是导致脊髓性肌萎缩的主要原因，SMN2基因的拷贝数与SMA临床表现严重程度相关。虽然SMN2基因与SMN1基因高度同源，仅存在5个碱基的差异，但SMN1可以表达稳定、完整的功能的SMN蛋白,而SMN2转录的大部分产物由于没有正确剪接，仅有约10％的mRNA拼接正确并翻译出具有正常活性SMN蛋白。研究表明，约95％的SMA患者存由7号外显子SMN1基因纯合缺失导致，另外5％的SMA患者7号外显子SMN1基因杂合缺失但仅存的SMN1拷贝上出现致病性突变或其他未知致病原因，需结合临床症状和Sanger测序等其他技术手段，方可确诊是否患有SMA疾病。由于存在高度同源且基因长度较长的SMN2基因，常规PCR结合Sanger测序难以避免SMN2基因的干扰，给该基因点突变的检测带来诸多困难。
[0003]目前临床上针对SMN1基因拷贝数检测主要检测方法：限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(PCR
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RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR
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DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR法、数字PCR技术(Digital PCR)等。PCR
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RFLP仅可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者的定性分析(即0拷贝)，不能检测杂合缺失型的携带者(即单拷贝)，而技术本身也存在酶切不完全导致错判的结果。PCR
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DHLPC法、MLPA法可用于检测纯合缺失型患者和杂合缺失型的携带者，且MLPA法可以实现对基因0拷贝、单拷贝、两拷贝、三拷贝及四拷贝的定量分析。然而，约有5％左右的SMA患者或携带者是因为存在SMN1基因点突变导致，而仅通过基因拷贝数定量分析无法有效进行相关疾病的确诊，导致出现误诊或漏诊。
[0004]专利CN109136366A中通过应用等位基因特性PCR(allele
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specific PCR，ASPCR)、毛细管电泳等技术对目的位点进行扩增，从而对野生型和突变型进行分型。由于野生型和突变型引物比较接近，难以区分；存在不同位点间的片段区分度不大、受毛细电泳管检测区间的长度的限制，且检测突变位点有限的等缺点。
[0005]专利CN111607645A利用基因分型芯片检测分析SMN1基因及SMN2基因拷贝数变异水平，并同时分析SMN1基因常见基因突变，实现SMA疾病的遗传诊断。但该技术检测灵敏度较低、操作复杂反应时间较长且成本昂贵不利于大规模推广、结果分析处理对专业性要求较高。
[0006]虽然诸如CN 105039318A、CN 103789440A、CN 104480206A等专利还提出了利用荧
光PCR等技术检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变的方案，但这些技术方案普遍存在准确性低、可靠性差、成本高而不利于产前诊断和大规模人群筛查等缺陷。

技术实现思路

[0007]本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于检测运动神经元基因突变的引物、试剂盒及分析方法，以解决现有技术所存在的不足。
[0008]本专利技术第一个专利技术目的在于，提供一种用于检测运动神经元基因突变的引物，采用的技术方案如下：一种用于检测运动神经元基因突变的引物，包括SMN1
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SNP五个突变位点的引物对，所述五个突变位点的引物对分别为c.863G＞T引物对、c.400G＞A引物对、c.689C＞T引物对、c.683T＞A引物对和c.22dupA引物对。
[0009]进一步，所述引物对按照对扩增后使产生的扩增子进行熔解时，不同突变位点的扩增子具有不同的Tm值进行配置。
[0010]进一步，所述引物对按照对扩增后使产生的扩增子进行熔解时，任意两个突变位点的扩增子之间的Tm值差异不小于1.5℃进行配置。
[0011]进一步，所述引物对中不包含与所述五个突变位点的引物对相对应的野生型引物对。
[0012]进一步，所述c.863G＞T引物对包含序列为SEQ ID NO：13的正向引物和序列为SEQ ID NO：14的反向引物；所述c.400G＞A引物对包含序列为SEQ ID NO：9的正向引物和序列为SEQ ID NO：10的反向引物；所述c.689C＞T引物对包含序列为SEQ ID NO：17的正向引物和序列为SEQ ID NO：18的反向引物；所述c.683T＞A引物对包含序列为SEQ ID NO：15的正向引物和序列为SEQ ID NO：16的反向引物；所述c.22dupA引物对，包含序列为SEQ ID NO：11的正向引物和序列为SEQ ID NO：12的反向引物。如表1所示：
[0013]表1 SMN1
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SNP突变位点主反应液中的引物序列
[0014][0015][0016]上述SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18引物设计采用ARMS
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PCR引物设计原则，同时通过不同靶点扩增子Tm值与内参基因扩增子Tm值的差值用来确定特定的突变位点靶向序列。
[0017]本专利技术第二个专利技术目的在于，提供一种试剂盒，采用的技术方案如下：一种试剂盒，包括SMN1
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SNP突变位点主反应液，所述突变位点主反应液中包含上述用于检测运动神经元基因突变的引物。
[0018]进一步，所述突变位点主反应液中还包含35～50mM Tris、2.5～3.0mM MgCl2、300～500mg/L BSA、2～5％DMSO、100～200μM dNTPs、20～50
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Syto9染料、纯化水。
[0019]进一步，所述试剂盒中还包含SMN1
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7主反应液、SMN1
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8主反应液，SMN1酶混合液、0拷贝数质控品、SMN1
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7单拷贝质控品、SMN1
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7两拷贝标准品、SMN1
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8单拷贝质控品、SMN1
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8两拷贝标准品、SMN1
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SNP突变型对照品及SMN1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测运动神经元基因突变的引物，其特征在于，包括SMN1
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SNP五个突变位点的引物对，所述五个突变位点的引物对分别为c.863G＞T引物对、c.400G＞A引物对、c.689C＞T引物对、c.683T＞A引物对和c.22dupA引物对。2.如权利要求1所述的用于检测运动神经元基因突变的引物，其特征在于，所述引物对按照对扩增后使产生的扩增子进行熔解时，不同突变位点的扩增子具有不同的Tm值进行配置。3.如权利要求1所述的用于检测运动神经元基因突变的引物，其特征在于，所述引物对按照对扩增后使产生的扩增子进行熔解时，任意两个突变位点的扩增子之间的Tm值差异不小于1.5℃进行配置。4.如权利要求1所述的用于检测运动神经元基因突变的引物，其特征在于，所述引物对中不包含与所述五个突变位点的引物对相对应的野生型引物对。5.如权利要求1
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4任一所述的用于检测运动神经元基因突变的引物，其特征在于，所述c.863G＞T引物对包含序列为SEQ ID NO：13的正向引物和序列为SEQ ID NO：14的反向引物；所述c.400G＞A引物对包含序列为SEQ ID NO：9的正向引物和序列为SEQ ID NO：10的反向引物；所述c.689C＞T引物对包含序列为SEQ ID NO：17的正向引物和序列为SEQ ID NO：18的反向引物；所述c.683T＞A引物对包含序列为SEQ ID NO：15的正向引物和序列为SEQ ID NO：16的反向引物；所述c.22dupA引物对，包含序列为SEQ ID NO：11的正向引物和序列为SEQ ID NO：12的反向引物。6.一种试剂盒，其特征在于，包括SMN1
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SNP突变位点主反应液，所述突变位点主反应液中包含上述权利要求1
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5任一所述的用于检测运动神经元基因突变的引物。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述突变位点主反应液中还包含35～50mM Tris、2.5～3.0mM MgCl2、300～50...

【专利技术属性】
技术研发人员：李政，王小舟，张扬，王雨，
申请(专利权)人：苏州天隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：