一种表达微菌素Y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种表达微菌素Y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用，属于基因工程技术和生物技术领域，本发明专利技术首先将mcyA和mcyBCD的基因序列调整为相同方向，并且用SD和起始密码子序列相连获取mcyABCD改造基因，然后以PHT43作为载体，通过枯草芽孢杆菌对改造后的mcyABCD基因进行表达并成功表达MccY，其表达产物具有良好的鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性，为MccY在养殖业生产实践中的应用提供了更经济便捷的模式。应用提供了更经济便捷的模式。应用提供了更经济便捷的模式。

【技术实现步骤摘要】
一种表达微菌素Y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用


[0001]本专利技术属于基因工程技术和生物
，具体涉及mcyABCD基因序列的改造和采用枯草芽孢杆菌(食品级益生菌)作为表达系统，对MccY的抗菌活性研究。

技术介绍

[0002]微菌素Y(MccY)是近期发现的一种来源于肠道菌的小分子抗菌肽，其生物合成需要四个基因参与，即mcyABCD，其中mcyA编码MccY的线性氨基酸前体，mcyB、mcyC和mcyD编码翻译后修饰蛋白，转运蛋白以及分泌和自身免疫相关蛋白。类似于微菌素J25(MccJ25)，MccY通过铁载体受体蛋白(FhuA)进入细菌，对细菌进行内部瓦解，进而杀死细菌，其主要针对鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和婴儿沙门氏菌等血清型以及部分志贺氏菌和大肠杆菌。
[0003]MccY的发现极大地扩展了现有微菌素的抑菌谱，尤其弥补了微菌素J25在抑制鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌等常见致病菌能力方面的缺陷。相似的是，它们都由肠杆菌分泌产生并且被发现，由于菌自身表达系统限制性的影响，极少有人使用革兰氏阳性菌作为表达系统，对此展开研究。目前，MccY的分泌表达是以大肠杆菌BL21菌株作为表达菌株，并且展现了良好的杀菌活性，但是由于大肠杆菌内毒素的影响，对于MccY的纯化具有很高的的要求，限制了其在养殖业生产实际中的应用。而作为革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌属于食品级益生菌，其表达的MccY在生产应用上具有更经济快捷的使用方法，可以避免内毒素的影响，简化纯化工艺，并且实现直接饲添和活菌肠道定殖等。由于微菌素的杀菌机理不同于抗生素，MccY有望在全面禁抗的行业背景下，成为一种新型药物制剂，而益生菌对于MccY的成功表达，开启了更经济便捷的生产模式。

技术实现思路

[0004]为了开发益生菌对微菌素Y的表达系统，本专利技术以PHT43作为载体，通过枯草芽孢杆菌对改造后的mcyABCD基因进行表达并成功表达MccY，其表达产物具有良好的鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性，为MccY在养殖业生产实践中的应用提供了更经济便捷的模式。
[0005]本专利技术的目的和采取的技术方案如下：
[0006]本专利技术的目的一在于提供用于在枯草芽孢杆菌中表达微菌素Y的多核苷酸，所述多核苷酸为mcyABCD改造基因或包含所述mcyABCD改造基因；所述mcyABCD改造基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示。
[0007]本专利技术的目的二在于提供一种包含上述多核苷酸的重组质粒。
[0008]优选地，所述重组质粒为PHT43
‑
mcyABCD，是将mcyABCD改造基因插入到PHT43质粒中构建所得。
[0009]本专利技术的目的三在于提供一种工程菌，所述工程菌包含上述的重组质粒。
[0010]优选地，所述工程菌为枯草芽孢杆菌工程菌株，是将重组质粒PHT43
‑
mcyABCD转入
枯草芽孢杆菌中制备所得。
[0011]本专利技术的目的四在于提供一种药物制剂，包含所述的工程菌或/和所述工程菌表达分泌的微菌素Y。
[0012]本专利技术的目的五在于提供一种微菌素Y的枯草芽孢杆菌表达系统，该表达系统将重组质粒PHT43
‑
mcyABCD转入枯草芽孢杆菌中，然后进行诱导表达。
[0013]本专利技术的目的六在于提供所述的枯草芽孢杆菌表达系统的构建方法，包括以下步骤：步骤一、设计携带对应同源臂的引物，分别扩增PHT43线性化片段、mcyA和mcyBCD片段并引入SD和起始密码子序列，然后进行多片段连接和环化，构建PHT43
‑
mcyABCD重组质粒；步骤二、将步骤一构建的PHT43
‑
mcyABCD重组质粒转入到大肠杆菌中进行阳性验证；步骤三、将经步骤二验证的PHT43
‑
mcyABCD重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中，利用IPTG进行诱导表达制备微菌素Y。
[0014]本专利技术的目的七在于提供所述的工程菌或7所述的枯草芽孢杆菌表达系统在制备微菌素Y或包含微菌素Y的抑菌制剂中的应用。
[0015]有益效果：本专利技术利用枯草芽孢杆菌，以PHT43作为载体，对改造后的mcyABCD基因进行表达，其表达产物对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有良好的杀伤性；该工程菌株标志着MccY可以突破芽孢杆菌表达系统的限制性，为其在益生菌上的应用提供广阔的前景。
附图说明
[0016]图1是PHT43
‑
mcyABCD重组质粒构建示意图；
[0017]图2是PHT43
‑
mcyABCD重组质粒转化大肠杆菌DH5α，部分阳性转化子的PCR验证产物凝胶电泳图；其中，扩增片段大小4965bp；
[0018]图3是枯草芽孢杆菌转化PHT43
‑
mcyABCD重组质粒的PCR产物凝胶电泳图；其中，A为BS168::PHT43
‑
mcyABCD阳性菌，B为WB800N::PHT43
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mcyABCD阳性菌，扩增片段大小为4965bp；
[0019]图4是枯草芽孢杆菌表达MccY，在0、4、6、8、12、16和24h的鼠伤寒沙门氏菌抑菌图；其中，C为BS168表达MccY，D为WB800N表达MccY，其中20～25梯度样本均按照0h所示的顺序；
[0020]图5是枯草芽孢杆菌WB800N表达MccY对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性对比图，其中，E：鼠伤寒沙门氏菌；F：鸡白痢沙门氏菌；其中20～25样本梯度点样顺序参照图4；
[0021]图6是枯草芽孢杆菌表达MccY质谱分析图；其中e和g分别表示在BS168菌株和WB800N菌株检测到的MccY异源表达，x轴表示保留时间，y轴表示响应值；f和h分别表示BS168菌株和WB800N菌株表达MccY的ESI
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MS分析，检测到对应带电荷MccY的m/z值为743.2Da[M+3H]3+
，x轴表示m/z(Da)值，y轴表示响应值。
具体实施方式
[0022]一种表达微菌素Y(MccY)的枯草芽孢杆菌工程菌株的开发，该工程菌株以PHT43作为载体，对改造后的mcyABCD基因进行表达，其表达产物对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏
菌具有良好的杀伤性；该工程菌株标志着MccY可以突破芽孢杆菌表达系统的限制性，为其在益生菌上的应用提供广阔的前景。
[0023]所述改造后的mcyABCD基因将mcyA和mcyBCD的基因序列调整为相同方向，并且用SD和起始密码子序列(AAAGGAGGAAAGATCAATG)相连，其核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示。
[0024]所述枯草芽孢杆菌为野生菌株BS168和工程菌株WB800N，表达质粒为PHT43，mcyABCD基因共用质粒自身P43启动子，验证杀菌活性所用的指示菌为鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)和鸡白痢沙门氏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于在枯草芽孢杆菌中表达微菌素Y的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为如下任意一种所述的序列：a)、核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示的mcyABCD改造基因；b)、包含mcyABCD改造基因的多核苷酸序列；c)、与mcyABCD改造基因同源性在90％以上且具有微菌素Y编码功能的的多核苷酸序列。2.一种重组质粒，所述重组质粒包含如权利要求1所述的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为PHT43
‑
mcyABCD，是将mcyABCD改造基因插入到PHT43质粒中构建所得。4.一种工程菌，所述工程菌包含如权利要求2或3所述的重组质粒。5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为枯草芽孢杆菌工程菌株，是将重组质粒PHT43
‑
mcyABCD转入枯草芽孢杆菌中制备所得。6.一种药物制剂，包含权利要求5所述的工程菌或/和权利要求5所述工程菌表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：张广文，冯赛祥，廖明，江金飞，谢倩梅，代绘琳，林敏，许斯祺，陈爱华，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：