一种枯草芽孢杆菌多基因模块化组装和诱导表达质粒及其构建方法技术

基于合成生物学的模块化设计理念，本发明专利技术的目的在于提供一种包含生物积木(BioBricks)模块的枯草芽孢杆菌诱导型表达质粒(命名为pBsubPB01)及其构建方法，该质粒可以实现模块化快速组装多个目的基因并在枯草芽孢杆菌中高效表达，涉及分子生物学、基因工程、合成生物学等技术领域。本发明专利技术所构建的生物积木模块如下：将同尾酶(XbaI和NheI)分别置于pHT01(大肠杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌多基因模块化组装和诱导表达质粒及其构建方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学、基因工程、合成生物学等
，具体包括一种基于生物积木模块的枯草芽孢杆菌模块化组装和多基因表达质粒的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌是我国农业部批准使用的益生菌，对抗生素无耐药性，对人畜无毒无害，绿色环保，对环境无污染，对作物安全，可产生多种抗生素，对多种动、植物与人类病原菌具有较好的抑制作用。而且该菌还具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，并具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。作为一种安全的底盘细胞，枯草芽孢杆菌广泛应用于各种酶类和化合物的合成。然而，目前尚缺乏快速便捷的多基因协同共表达质粒工具。
[0003]生物积木(BioBricks)是合成生物学的一项重要内容，每一个积块都拥有标准化接头，积块之间按一定操作流程可以任意组装成更高层次的系统。这些标准化的部件和操作流程形成了合成生物学区别于现有生物学其他学科的主要特点，即“工程化”。将合成生物学的设计理念和工程化的本质引入到异源表达系统中，不仅可以使单个表达系统的构建显得简便易行，而且更方便研究人员对表达系统进行改造和多方向探索。
[0004]本专利技术基于合成生物学的标准化思路，将生物积木模块引入到枯草芽孢杆菌表达载体，从而实现对多个目的基因进行模块化快速组装，并在枯草芽孢杆菌中协同共表达。本专利技术所构建的质粒适用于构建和优化由多基因组成的合成途径等，能够满足以枯草芽孢杆菌为底盘的合成生物学对此类工具的需求。
专利技术内容
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种包含生物积木模块的枯草芽孢杆菌多基因模块化组装和诱导表达质粒(命名为pBsubPB01)及其构建方法，从而实现多基因的快速组装、优化和在枯草芽孢杆菌中的协同诱导表达。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种包含BioBricks模块的枯草芽孢杆菌表达质粒及其构建方法，所述质粒为闭合环状双链DNA。
[0008]可选的，所述的BioBricks模块包括：同尾酶(XbaI)、诱导型嵌合启动子Pgrac、核糖体结合位点RBS、多克隆位点MCS、prtA终止子、同尾酶(NheI)和限制性内切酶(BglII)。
[0009]可选的，所述的BioBricks模块利用同尾酶的迭代使用对含有目的基因的模块进行快速组装，组装后的目的基因以操纵子的形式串联。
[0010]可选的，所述的启动子为枯草芽孢杆菌诱导型嵌合启动子Pgrac，可由异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，终止子为prtA终止子。
[0011]可选的，所述的同尾酶为XbaI和NheI。
[0012]可选的，所述的质粒还包括氨苄青霉素和氯霉素抗性基因，是大肠杆菌和枯草芽
孢杆菌的穿梭质粒。
[0013]所述的质粒载体构建方法如下：
[0014]本专利技术所构建的质粒基于枯草芽孢杆菌常用质粒pHT01，为了在BioBricks模块中利用NheI和BglII两个酶切位点，需要先将pHT01中原有的NheI和BglII两个酶切位点突变掉。具体操作如下：
[0015]以pHT01为模板，Frg1 F和Frg1 R为上下游引物(表1)进行PCR扩增，扩增产物命名为Frg.1；以pHT01为模板，以Frg2 F和Frg2 R为上下游引物(表1)进行PCR扩增，扩增产物命名为Frg.2。PCR扩增的反应体系为：2
×
Phanta Max Mixture 25μL(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，上下游引物(100μM)各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌超纯水23μL，合计50μL。PCR反应结束后，使用限制性内切酶DpnI(ThermoFisher Scientific)消化残留的模板DNA(pHT01质粒)。琼脂糖凝胶电泳，分别回收4888
‑
bp(Frg.1)和3106
‑
bp(Frg.2)的片段。将回收得到的目的片段进行一步克隆(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，得到消除了酶切位点NheI和BglII的重组质粒pHT01_NBXrmv。
[0016]含有BioBricks模块的DNA序列(命名为BsubPB01
‑
Cassate)由上海生工生物工程有限公司合成并克隆至载体pUC57的KpnI和BglII位点之间，得到pUC57
‑
BsubPB01
‑
Cassate。使用KpnI和BglII对质粒pHT01_NBXrmv和pUC57
‑
BsubPB01
‑
Cassate分别进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳后，分别回收7707
‑
bp和261
‑
bp的DNA片段。使用T4连接酶(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)连接，得到含有BioBricks模块的目的质粒pBsubPB01(质粒结构如图1所示)。
[0017]相比于现有的技术，本专利技术具有以下有益效果：
[0018]将生物积木(BioBricks)模块引入到枯草芽孢杆菌表达质粒，可以实现多基因的模块化快速组装，及其在枯草芽孢杆菌中的共表达。利用这种标准化和模块化的结构，简化多基因在枯草芽孢杆菌中表达的操作流程。使用诱导型嵌合启动子Pgrac控制目的基因的表达，实现对目的基因表达时间的控制，可用于对底盘有害目的基因的表达。
[0019]在本专利技术实施例中，分别使用增强型绿色荧光蛋白的编码基因EGFP和β
‑
半乳糖苷酶的编码基因LacZ验证pBsubPB01表达外源基因的能力；通过不同拷贝数EGFP和LacZ的组装和表达，来验证pBsubPB01的模块化快速组装、优化和多基因协同共表达能力。
附图说明
[0020]图1.质粒pBsubPB01结构图谱。其中，BioBricks模块由同尾酶(XbaI)、Pgrac诱导型启动子、核糖体结合位点RBS、多克隆位点MCS、prtA终止子、同尾酶(NheI)和限制性内切酶(BglII)组成。
[0021]图2.使用增强型绿色荧光蛋白编码基因EGFP验证pBsubPB01表达外源基因能力。荧光信号使用多功能酶标仪读取，激发光和发射光分别为488nm和520nm。其中，含有空白质粒pBsubPB01的枯草芽孢杆菌作为空白对照，含有重组质粒pBsubPB01
‑
EGFP的枯草芽孢杆菌为实验组。
[0022]图3.使用β
‑
半乳糖苷酶编码基因LacZ验证pBsubPB01表达外源基因能力。图片为在发酵液中添加底物5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
半乳糖苷(X...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含生物积木(BioBricks)模块的枯草芽孢杆菌诱导表达质粒及其构建方法，其特征在于，所述的质粒可以利用BioBricks模块将多个目的基因进行快速组装，以实现这些基因在枯草芽孢杆菌中的共表达。2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述的BioBricks模块利用同尾酶的迭代使用将多个目的基因进行模块化组装。3.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述的BioBricks模块(按5
’→3’
顺序)由同尾酶(XbaI)、启动子、核糖体结合位点RBS、多克隆位点MCS、终止子、同尾酶(NheI)和限制性内切酶(BglII)组成。4.根据权利要求1和权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述的启动子为枯草...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕永坤，许敬亮，任静，张辉，朱丽娟，熊文龙，阿拉牧，屈凌波，应汉杰，王诗元，余高田，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：