一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶技术

本发明专利技术公开了一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶。本发明专利技术的基因工程菌的制备方法包括：去除壳聚糖酶编码基因csn信号肽编码序列；将芽孢杆菌信号肽编码序列连接csn，插入大肠杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶


[0001]本专利技术涉及一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶，属于生物工程


技术介绍

[0002]甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大天然类高分子化合物，经脱乙酰后成为壳聚糖。壳聚糖含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有可生物降解、细胞亲和性和多种生物活性。但是，由于壳聚糖水溶性差，难以发挥大多数生物活性，大大限制壳聚糖的应用。近年发现壳聚糖的水解产物壳寡糖具有独特的生理活性。壳寡糖由2
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20个单糖通过糖苷键连接，相较于壳聚糖具有水溶性好、易于吸收、功能性强、生物活性高等特点，被科学界誉为“第六大生命元素”，在食品、药品、生物等领域应用广泛。因此，关于壳寡糖的生产受到广大研究人员的高度重视，也取得显著成效。
[0003]目前，壳寡糖常见的制备方法有物理降解法和化学降解法。物理降解法以微波、超声波、辐照、射线、加热、加压等方式断裂壳聚糖分子中的糖苷键。物理法污染小，产物纯度高且结构简单，但设备成本高、生产效率低，因此通常与其他方法结合，工业上未建立纯物理法大规模生产壳寡糖。目前工业化生产壳寡糖的传统方法是化学降解法，即酸法水解制备壳寡糖。利用壳聚糖分子中的氨基基团与酸性溶液中的氢离子结合，使壳聚糖分子间氢键断裂，形成聚合度不同的混合产物。该方法技术要求相对较低，降解速度快，设备、原料成本较低，非常适合工业化生产。但化学法反应复杂，难以控制，降解副产物多，污染大，且水解反应会破坏壳聚糖分子中的糖苷键，过度水解时糖苷键全部断裂生成单糖，因此分离纯化成本高，壳寡糖收率低。
[0004]随着生物技术的发展，酶法逐渐被应用于壳寡糖的制备。壳聚糖酶(Chitosanase)通常由细菌、放线菌、真菌等微生物发酵生产，其中细菌来源最丰富，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属等。壳聚糖酶属水解酶，可分为内切酶和外切酶。其中壳聚糖内切酶以内切方式专一性水解壳聚糖分子中的β
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1,4糖苷键。壳聚糖酶水解制备壳寡糖工艺对环境友好，可以低成本控制产品的聚合度。与前两种方法相比，酶法制备壳寡糖可克服物理法得率低与化学法选择性差的缺点，且因其高效可控、条件温和、选择性高等优点近年逐渐引发关注。
[0005]壳聚糖酶可通过菌株分泌获得，由于大多数野生菌株产壳聚糖酶效率低，成本高，造成壳寡糖生产成本相应提高，限制了酶解法制备壳寡糖的工业化应用。菌种筛选、高密度发酵、优化培养条件等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株壳聚糖酶产量，但仍难以满足工业化需求。随着科技进步，构建重组壳聚糖酶并用于壳寡糖制备成为发展趋势。然而胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤，不仅提高了酶的制备成本，酶活也会受到影响。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是：目前胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤，从而导致壳聚糖酶的制备成本高和酶活下降等问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008]步骤1：通过PCR反应将编码壳聚糖酶的csn基因和信号肽编码DNA序列融合，得到融合后的基因片段；所述csn基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述信号肽编码DNA序列如SEQ ID No.2所示；
[0009]步骤2：将融合后的基因片段插入穿梭表达载体中，得到重组表达质粒；
[0010]步骤3：将重组表达质粒转化入宿主菌中，即得所述的基因工程菌。
[0011]优选地，所述步骤2中的穿梭表达载体为大肠杆菌
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芽孢杆菌穿梭表达载体，所述大肠杆菌
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芽孢杆菌穿梭表达载体为pJKK502、pSUGV4、pBE2RS、pGDVM或pHT304。
[0012]优选地，所述步骤3中的宿主菌为芽孢杆菌属细菌，所述的芽孢杆菌属细菌为Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis。
[0013]本专利技术还提供了上述基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌。
[0014]本专利技术还提供了上述基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌在制备重组壳聚糖酶中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种基因工程菌BM103，所述的基因工程菌BM103于2021年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC24021，分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus subtilis。
[0016]本专利技术还提供了一种重组壳聚糖酶，所述的重组壳聚糖酶中包含由SEQ ID No.1所示的csn基因编码的蛋白质G，所述的蛋白质G由SEQ ID No.2所示的基因片段编码的信号肽分泌表达。
[0017]优选地，所述的重组壳聚糖酶通过以下步骤制得：
[0018]步骤1：将上述的基因工程菌BM103接种于LB培养基中培养，得到细菌培养液；
[0019]步骤2：将步骤1所得的细菌培养液接种于新鲜的LB培养基中，得到培养液；
[0020]步骤3：将步骤2所得的培养液离心分离后收集上清液，依次经过醇沉和亲和层析，即得纯化的重组壳聚糖酶。
[0021]优选地，所述步骤1中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下振荡培养12
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14h。
[0022]优选地，所述步骤2中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下进行振荡培养，直至培养液的OD
600
值达到1.7
‑
1.9。
[0023]优选地，所述步骤1和步骤2中的LB培养基中含有卡那霉素。
[0024]更优选地，所述卡那霉素的浓度为40～60μg/mL。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0026]1.本专利技术通过基因工程手段构建可高效表达和分泌壳聚糖酶的基因工程菌，只需要在适宜条件下培养即可将有活性的壳聚糖酶表达和分泌至宿主细胞的胞外，再通过简单醇沉及亲和层析等方法进行分离纯化，即可获得高纯度重组壳聚糖酶，可大大降低酶解法制备壳寡糖的生产成本；
[0027]2.本专利技术制备壳聚糖酶的工艺简单，无需细胞破碎，直接从培养上清即可纯化制
备壳聚糖酶，克服了目前胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤从而导致酶活受影响及成本高的缺陷，本专利技术的方法适于工业放大，可广泛应用于食品、药品、生物等领域。
附图说明
[0028]图1为实施例1中PCR反应条件；
[0029]图2为双酶切验证融合基因的琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]图3由基因工程菌BM103制备的重组壳聚糖酶的SDS
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PAGE电泳图；
[0031]图4为壳寡糖标准品校正曲线和重组壳聚糖酶酶解产物的凝胶渗透色谱图。
[0032]保藏说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：通过PCR反应将编码壳聚糖酶的csn基因和信号肽编码DNA序列融合，得到融合后的基因片段；所述csn基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述信号肽编码DNA序列如SEQ ID No.2所示；步骤2：将融合后的基因片段插入穿梭表达载体中，得到重组表达质粒；步骤3：将重组表达质粒转化入宿主菌中，即得所述的基因工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的穿梭表达载体为大肠杆菌
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芽孢杆菌穿梭表达载体，所述大肠杆菌
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芽孢杆菌穿梭表达载体为pJKK502、pSUGV4、pBE2RS、pGDVM或pHT304。3.如权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的宿主菌为芽孢杆菌属细菌，所述的芽孢杆菌属细菌为Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis。4.权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌。5.权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌在制备重组壳聚糖酶中的应用。6.一种基因工...

【专利技术属性】
技术研发人员：李茜茜，杨云洁，叶扬志，荣绍丰，管世敏，蔡宝国，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：