纳豆激酶重组表达载体、重组基因工程菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及纳豆激酶重组表达载体、重组基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。在所述的载体的启动子之前串联有1个如SEQ ID N0.1所示的启动子，所述重组表达载体的信号肽为SEQ ID N0.2对应的核苷酸。本发明专利技术还提供含上述重组表达载体的重组基因工程菌，所述为枯草芽孢杆菌WB800。本发明专利技术还提供所述重组表达载体和重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。重组表达载体和重组基因工程菌中的纳豆激酶基因来源于纳豆芽孢杆菌Bacillus natto N2，较原始启动子和信号肽，本发明专利技术纳豆激酶的表达量从22.3FU/mL增加至247.1FU/mL。表达量从22.3FU/mL增加至247.1FU/mL。表达量从22.3FU/mL增加至247.1FU/mL。

【技术实现步骤摘要】
纳豆激酶重组表达载体、重组基因工程菌及应用


[0001]本专利技术涉及纳豆激酶的重组表达载体、重组基因工程菌及应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]纳豆激酶(Nattokinase，NK，EC 3.4.21.62)是在纳豆发酵过程中，其中的纳豆芽孢杆菌利用黄豆中的营养，发酵产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。该酶因其高效安全的溶栓能力，在心脑血管疾病领域掀起研究热潮。在此之前，常用临床溶栓药物主要有链激酶、尿激酶和纤维酶原激活因子等，但此类药物存在成本高昂、安全性低且药效短等弊端，不宜进行规模化生产。纳豆激酶无论在成本还是安全性方面均有显著优势，特别是它可直接作用于纤维蛋白，大大提高溶栓效率，使其与上述溶栓药物相比具有独特优越性和广阔开发前景。此外，纳豆激酶被证实在血压血脂调节方面有显著效果，且在抗疲劳、抗菌、抗氧化、调节内分泌等方面有研究价值，是一种高潜力的膳食补充剂，在食品工业上具有较大开发意义。
[0003]Nakamura等人(1992)通过当时较为精确的鸟枪法首次克隆了纳豆激酶基因，并对其一级结构进行深入解析，测定了该酶的全基因序列，从此科研工作者开始从分子水平，利用基因工程手段对纳豆激酶基因或其宿主进行改造和优化。
[0004]启动子(Promoter)是DNA转录起始所必须的一段保守序列，含有RNA 聚合酶特异性结合位点，位于基因转录起始位点(Transcription Start Site，TSS) 上游，它控制转录强度，是实现异源表达的关键元件。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于提供生产纳豆激酶的重组表达载体、重组基因工程菌及应用，本专利技术以枯草芽孢杆菌为宿主，通过改造信号肽和串联启动子的方式，构建了枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，提高蛋白酶活力。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0007]一种纳豆激酶重组表达载体，载体为pP43NMK，在所述的载体的启动子之前串联有1个如SEQ ID N0.1所示的启动子；
[0008]进一步的，所述重组表达载体的中纳豆激酶基因的信号肽为SEQ ID N0.15。
[0009]本专利技术还提供含上述重组表达载体的重组基因工程菌，所述菌株枯草芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌WB800。
[0010]本专利技术还提供所述重组表达载体在生产纳豆激酶中的应用。
[0011]本专利技术还提供所述重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。
[0012]作为优选的实施例，重组表达载体和重组基因工程菌中的重组目的基因纳豆激酶基因来源于纳豆芽孢杆菌Bacillus natto N2，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示
[0013]本专利技术与现有技术相比的有益效果：
[0014]1、本实验实现了纳豆芽孢杆菌BacillusnattoN2来源的纳豆激酶基因在枯草芽孢杆菌WB800中的高效表达。
[0015]2、本专利技术提供了一种串联启动子同时对信号肽进行改造的方式构建的基因工程菌以提供纳豆激酶的表达量，所述表达量从22.3FU/mL增加至247.1FU/mL。
附图说明
[0016]图1是实施例1中Nattokinase基因扩增电泳图；其中泳道M：markerDNA；泳道1为构建的启动子片段；
[0017]图2是实施例1中Nattokinase基因菌落PCR结果图；其中泳道M：markerDNA；泳道1为构建的启动子片段；
[0018]图3实施例2中构建信号肽与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较。
[0019]图4是实施例3中串联启动子结构示意图；Px表示增加的启动子，P43是所用质粒载体pP43NMK的启动子，即载体pP43NMK所原有的启动子。Sp7为改造后筛选出来的信号肽，Pro
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nk是目的基因，即纳豆激酶基因；
[0020]图5是实施例3中串联启动子扩增电泳图；其中泳道M：markerDNA；泳道1为构建的启动子片段；
[0021]图6是实施例4中串联启动子与原启动子引导的纳豆激酶酶活力的比较。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0023]以下实施例中所采用的的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ，RussellDW，JanssenK，ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。实施例中所用的核苷酸序列和氨基酸序列如表1所示。
[0024]枯草芽孢杆菌WB800可以购买商业菌株，本实施例所用的枯草芽孢杆菌WB800为中国海洋大学食品学院应用微生物实验室保藏；
[0025]枯草芽孢杆菌N2是由中国海洋大学食品学院应用微生物实验室筛选并于2020年3月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC：NO.19541，保存地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0026]实施例1纳豆激酶高效分泌表达的信号肽的筛选
[0027]通过优化纳豆激酶的信号肽，构建各种信号肽与纳豆激酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，从克隆中获得提高纳豆激酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：
[0028](1)构建pP43NMK
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NKF载体：提取枯草芽孢杆菌N2基因组DNA(天根，细菌基因组提取试剂盒),以两段人工合成片段SEQIDN0.3、SEQIDN0.4从枯草芽孢杆菌N2基因组DNA中PCR扩增钓取纳豆激酶基因，核酸电泳验证(图1)并纯化回收目的片段待用；以两段人工合成片段SEQIDN0.5、SEQIDN0.6从pP43NMK中PCR扩增得到线性化pP43NMK片段；利用DNA无缝克隆(ClonExpressIIOneStepCloningKit试剂盒)重组连接纳豆激酶基因和线性化pP43NMK片段，构建重组克隆载体pP43NMK
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NKF，核酸电泳验证(图2)。
[0029](2)构建信号肽缺失型线性化载体PSP0：设计引物SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8基于pP43NMK
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NKF,进行线性化载体扩增，制得PSP0线性化载体片段。线性化的载体用Fast Digest DpnI进行消化处理，处理后的片段使用纯化试剂盒 (E.Z.N.Cycle Pure Kit D6492)纯化后回收备用。
[0030](3)YqxM信号肽的钓取及纯化：设计引物SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10 (在实施例中实际设计了很多引物并调取相应的信号肽，但只有设计引物SEQID N0.9和SEQ ID N0.10信号肽对纳豆激酶活性提高最大)，以枯草芽孢杆菌 WB800基因组为模板，选择梯度PCR的方式钓取目的基因，扩增体系50μl： 5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳豆激酶重组表达载体，其特征在于载体为pP43NMK，在所述的载体的启动子之前串联有1个如SEQ ID N0.1所示的启动子。2.根据权利要求1所述的一种纳豆激酶重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的中纳豆激酶基因的信号肽为SEQ ID N0.15。3.含有权利要求1或2所述纳豆激酶重组表达载体的重组基因工程菌，其特征在于菌株为枯草芽孢杆菌。4.根据权利要求3所述的重组基因工程菌，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，辜自强，宁晨，刘哲民，朱常亮，
申请(专利权)人：威海迪普森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：