【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体地涉及一种介导协氧蛋白fhb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌和应用。
技术介绍
1、毕赤酵母目前作为基础菌株已经成功表达了用于医药、农业等领域的重组蛋白400多种，是常用的蛋白质表达系统之一。相较于大肠杆菌和枯草芽孢表达系统，其可以实现有效的分泌表达，无需后期过多的分离和纯化目标蛋白，外源基因整合到基因组中可稳定表达且容易实现高密度发酵制备目标产物。
2、由于毕赤酵母为高好氧微生物,在当前高密度发酵的过程中，常常受限于设备供氧能力，细胞密度和氧化降解甲醇的速率无法进一步提高，从而影响目标蛋白的表达量。黄素血红蛋白(flavohemoglobin，fhb)是一类存在于细菌、酵母等单细胞生物中的血红蛋白。它包含一个n端血红蛋白结构域和一个c端氧化还原酶结构域，它们具有nad(p)h和fad的潜在结合位点。fhb被认为在o2感应、储存和传递中发挥作用。
3、当前在毕赤酵母工程菌中表达fhb蛋白的主要模式为将目标蛋白和fhb蛋白的基因进行串联，利用载体上的醇氧化酶启动子(aox),控制外源蛋白在宿主中的表达。一个转录单元表达双基因容易导致远离启动子的目的基因无法充分表达。
技术实现思路
1、本专利技术针对单启动子无法充分表达双基因的问题提供一种介导协氧蛋白fhb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌和应用，本专利技术通过构建将克隆得到的黄素血红蛋白基因fhb1利用gap启动子将其分泌到胞外，利用aox启动子表达产褐藻胶裂解酶的基因，提高了菌体表达fhb
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、一种介导协氧蛋白fhb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌和应用，所述重组工程菌由两个转录单元组成，一个转录单位为gap-α-fhb1-aox1tt，另一个转录单元为aox-α-102c300c-aox1tt，两个转录单元在ppiczαa质粒中串联表达。
4、所述协氧蛋白fhb1基因的核苷酸序列为seqidn0.1；所述转录单元gap-α-aox1tt的核苷酸序列如seqidn0.2，褐藻胶裂解酶的核苷酸序列为seqidn0.3。
5、优选的实施方式之一，所述重组菌的制备方法为将协氧蛋白的基因fhb1连接到pgapzαa质粒上，构建pgapzαa-fhb1重组质粒，从pgapzαa-fhb1质粒基因组中pcr扩增gap-α-fhb1-aox1tt片段，再将gap-α-fhb1-aox1tt连接到ppiczαa-102c300c的bglii位点上，使其形成双转录单元，在真核表达系统中分泌表达。
6、优选所述真核表达系统为毕赤酵母。更进一步优选为毕赤酵母x33。
7、本专利技术还提所述重组菌在提高褐藻胶裂解酶分泌表达中的应用。
8、本专利技术相与现有技术相比的有益效果：
9、1、本专利技术通过gap启动子表达核苷酸序列为seqidn0.1，即协氧蛋白fhb1基因，褐藻胶裂解酶的核苷酸序列为seqidn0.3，构建协氧蛋白基因fhb1与褐藻胶裂解酶编码基因共表达的重组载体，提高了产褐藻胶裂解酶工程菌在低氧环境中的分泌表达。
10、2、本专利技术提供了一种双转录单元表达协氧蛋白质粒，所述质粒能在低氧的环境中提高菌体对氧气的利用率，实现褐藻胶裂解酶的高表达，特别是为毕赤酵母菌表达褐藻胶裂解酶基因提供了有效的元件。
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1.一种介导协氧蛋白FHb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌，其特征在于，所述重组工程菌由两个转录单元组成，一个转录单位为GAP-α-FHb1-AOX1TT，另一个转录单元为AOX-α-102C300C-AOX1TT，两个转录单元在pPICZαA质粒中串联表达。
2.根据权利要求1所述的一种介导协氧蛋白FHb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌，其特征在于，所述协氧蛋白FHb1基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1；所述转录单元GAP-α-AOX1TT的核苷酸序列如SEQ ID N0.2，褐藻胶裂解酶的核苷酸序列为SEQ ID N0.3。
3.权利要求1所述的一种介导协氧蛋白FHb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌的制备方法，其特征在于，所述重组菌的制备方法为将协氧蛋白FHb1的基因连接到pGAPZαA质粒上，构建pGAPZαA-FHb1重组质粒，从pGAPZαA-FHb1质粒基因组中PCR扩增GAP-α-FHb1-AOX1TT片段，再将GAP-α-FHb1-AOX1TT连接到pPICZαA-102C300C的BglII位点上，使其形成双转录单元，在真核表达系统中分泌表达。
4.根据权利要求3所述的一种介导协氧蛋白FHb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌的制备方法，其特征在于，所述真核表达系统为毕赤酵母。
5.根据权利要求3所述的一种介导协氧蛋白FHb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌的制备方法，其特征在于，所述真核表达系统为毕赤酵母X33。
6.权利要求1所述的重组菌在提高褐藻胶裂解酶分泌表达中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种介导协氧蛋白fhb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌，其特征在于，所述重组工程菌由两个转录单元组成，一个转录单位为gap-α-fhb1-aox1tt，另一个转录单元为aox-α-102c300c-aox1tt，两个转录单元在ppiczαa质粒中串联表达。
2.根据权利要求1所述的一种介导协氧蛋白fhb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌，其特征在于，所述协氧蛋白fhb1基因的核苷酸序列为seq id n0.1；所述转录单元gap-α-aox1tt的核苷酸序列如seq id n0.2，褐藻胶裂解酶的核苷酸序列为seq id n0.3。
3.权利要求1所述的一种介导协氧蛋白fhb1和褐藻胶裂解酶基因的重组菌的制备方法，其特征在于，所述重组菌的制备方法为将协...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，辜自强，牛飞宇，王双童，朱琳，
申请(专利权)人：威海迪普森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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