一种束毛球菌的应用及分离鉴定方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种束毛球菌的应用及分离鉴定方法。该菌保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年01月12日，保藏编号为：CGMCCNo.26449。本发明专利技术提供了一种来源于岔黑猪肠道的一株本土益生菌

【技术实现步骤摘要】
一种束毛球菌的应用及分离鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种束毛球菌的应用及分离鉴定方法。

技术介绍

[0002]褐藻酸寡糖由于分子量较低、水溶性以及稳定性较好，目前已经被列入新饲料添加剂目录中，并表现出良好的抗氧化、免疫条件、抑菌等活性。例如，褐藻酸寡糖可诱导巨噬细胞RAW264.7产生白介素IL
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1a、IL
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1b、IL
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6以及TNF
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α；诱导NO产生，促进ROS以及TNF
‑
α的产生从而激活免疫细胞发挥免疫功能。褐藻酸寡糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用。但褐藻酸寡糖进入动物肠道中，会如何被肠道微生物所代谢，特别是动物肠道中是否存在对褐藻酸寡糖具有良好代谢行为和/或利用褐藻酸寡糖合成短链脂肪酸等的微生物，这些问题都是目前所未知的。其中，猪肠道的微生态环境与人体差别很大，其肠道内是否存在能够利用褐藻酸寡糖的菌，是否存在能利用褐藻酸寡糖合成短链脂肪酸的菌，也是有待研究的。
[0003]褐藻酸寡糖在体外培养中有利于双歧杆菌的增殖，具有较好的益生元潜力。所以，关于束毛球菌的益生活性和对褐藻酸寡糖的利用研究，具有深远的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是关于束毛球菌在动物肠道内的益生活性和对褐藻酸寡糖的利用研究，还未见报道。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种来源于岔黑猪肠道的一株本土益生菌
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束毛球菌PTS
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01，该株束毛球菌菌株能够对褐藻酸寡糖产生良好的代谢能力，并表现出短链脂肪酸的形成活性。因此，本专利技术的束毛球菌和褐藻酸寡糖具有良好的复合性能，为将来用于猪健康养殖的合生元的开发提供有效工具。
[0006]为达到上述目的，本专利技术主要通过以下技术手段实现：一种束毛球菌PTS
‑
01(分类命名：束毛球菌Trichococcus sp.)，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年01月12日，保藏编号为：CGMCC No.26449。
[0007]本专利技术的束毛球菌PTS
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01，是首次从猪肠道中分离出来，且具有降解褐藻酸寡糖能力的益生菌，具有编码kdgk的基因和有编码KDPG醛缩酶的基因，从而可以利用褐藻酸寡糖产生乙酸、甲酸、乳酸，其中乙酸可以在肠道中可以促进丁酸产生菌的增长，进而增强动物免疫力和抗病能力,减少畜禽养殖过程中抗菌药物的使用。
[0008]上述束毛球菌PTS
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01在制备代谢降解褐藻酸寡糖制品中的应用，特别是相关兽用益生菌制品中的应用。
[0009]一种上述束毛球菌PTS
‑
01的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0010](1)将里岔黑猪肠道内容物用生理盐水稀释，移入培养皿，加入50℃尚未凝固的培养基混匀，37℃培养，取其中球菌的典型菌落划线培养；将37℃厌氧培养48h划线培养后得
到的束毛球菌，接种到液体培养基中，37℃厌氧培养24小时；
[0011](2)取步骤(1)中的菌液转移至EP管中，用接种环蘸取菌液进行平行划线培养，划线后的培养皿(步骤(1)中同样的固体培养基)放至37℃左右的温暖处进行厌氧培养，待1
‑
2d长出菌落后，接种液体培养基(同步骤(1))，得到纯化后的束毛球菌PTS
‑
01。
[0012]进一步的，所述固体营养基成分如下：0.25gNH4HCO3、2.18gNaHCO3、0.36g Na2HPO4、0.39g KH2PO4、0.0375g MgSO4·
7H2O、2g酵母浸粉、10g褐藻酸寡糖、0.5g L
‑
半胱氨酸盐酸盐、1mL刃天青、1
‑
2％的琼脂，PH为7.2。
[0013]进一步的，所述液体培养基成分如下：0.25gNH4HCO3、2.18gNaHCO3、0.36g Na2HPO4、0.39g KH2PO4、0.0375g MgSO4·
7H2O、2g酵母浸粉、10g褐藻酸寡糖、0.5g L
‑
半胱氨酸盐酸盐、1mL刃天青，PH为7.2。
[0014]本专利技术的有益效果在于：(1)得到了一株源自里岔黑猪的本土益生菌
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束毛球菌PTS
‑
01，并证实了该菌可以作为益生菌降解利用褐藻酸寡糖。(2)提供一种分离培养与纯化猪源束毛球菌的方法。
附图说明
[0015]图1是微观形态图及扫描电镜图；其中，(A)显微镜形态图(
×
1000)(B)A图的扩大版(C)扫描电镜图；
[0016]图2是采用最大概率法对26#菌的16S rRNA基因进行进化树分析。
[0017]图3是PTS
‑
01基因注释到的KEGG pathway分类。
[0018]图4是发酵72h后束毛球菌PTS
‑
01的pH以及OD变化A+J:寡糖组J：无寡糖组。
[0019]图5是TLC分析不同时间段内褐藻酸寡糖(AlgO)的利用情况。
[0020]图6是褐藻酸寡糖发酵不同时间内的体积排阻色谱图；其中，A:二糖B:三糖C：四糖D:五糖。
[0021]图7是新物质的一级MS图。
[0022]图8是发酵不同时间段内SCFAs的浓度A+J:寡糖组J：无寡糖组。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]实施例1：束毛球菌PTS
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01的分离与纯化
[0025](1)束毛球菌PTS
‑
01的分离
[0026]固体培养基：0.25gNH4HCO3、2.18g NaHCO3、0.36g Na2HPO4、0.39g KH2PO4、0.0375g MgSO4·
7H2O、2g酵母浸粉、10g褐藻酸寡糖、0.5g L
‑
半胱氨酸盐酸盐、1mL刃天青、1
‑
2％的琼脂，PH调制成7.2,总体积为1L，高温高压灭菌20分钟后铺成平板备用。
[0027]液体培养基：0.25gNH4HCO3、2.18g NaHCO3、0.36g Na2HPO4、0.39g KH2PO4、0.0375g MgSO4·
7H2O、2g酵母浸粉、10g褐藻酸寡糖、0.5g L
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半胱氨酸盐酸盐、1mL刃天青PH调制成7.2，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种束毛球菌，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.26449。2.权利要求1中的束毛球菌在制备代谢降解褐藻酸寡糖制品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述束毛球菌在制备提升动物体内短链脂肪酸含量制品中的应用。4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述制品为猪养殖用合生元。5.一种权利要求1中的束毛球菌的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将里岔黑猪肠道内容物用生理盐水稀释，移入培养皿，加入固体营养基，37℃培养，取其中球菌的典型菌落划线培养；将37℃厌氧培养48h划线培养后得到的束毛球菌，接种到液体培养基中，37℃厌氧培养24小时；(2)取步骤(1)中的菌液转移至EP管中，用接种环蘸取菌液进行平行划线培养，划线后的培养皿放至37℃左右的温暖处进行厌氧培养，待1
‑
2d长出菌落后，接种液体培养基，得到纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝小静，牟海津，周围，韩振莲，于颖，任昕淼，代永联，刘华伟，
申请(专利权)人：威海迪普森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：