一种重组抗菌肽E-EJ97、重组表达载体、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组抗菌肽E

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗菌肽E
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EJ97、重组表达载体、工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程及生物
，具体涉及一种重组抗菌肽E
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EJ97、重组表达载体、工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]在畜牧业中，抗生素具有广谱防范动物细菌感染、以达到预防微生物源疾病的作用，但是其超剂量使用与滥用可能产生多重耐药性细菌，且抗生素残留问题日益严重，因此在多个国家和地区已明令禁止使用抗生素。随着“无抗养殖”概念的提出与推广，抗菌肽作为一种可以有效替代抗生素的天然活性物质，具有兼顾安全性、专一性、高效的抗菌活性等优势，为解决抗生素替代物的问题展现了一种新的思路。
[0003]粪肠球菌是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于人和其他动物的肠道、上呼吸道，能够产生多种抗生素和抗菌肽。粪肠球菌可作为添加剂添加到动物饲料中，因此可以认为粪肠球菌属于一种无毒无害的有益菌。粪肠球菌中存在的多种抗菌肽在商用以及医疗方面有所应用，例如抗菌肽ST4SA可以抑制李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌；肠毒素K1(EntK1)对屎肠球菌抑制作用显著。粪肠球菌细菌素能够对多种革兰氏阳性菌表现出快速且持续的抑制活性，对单核细胞增生李斯特菌等食源性病原体具有抑制活性；但其抗菌谱较窄，对革兰氏阴性菌的抑制活性相对较弱。如果能够将粪肠球菌中的某些独特、高效、安全的抗菌肽优化改良并大规模生产制备，或可作为饲料添加剂应用于畜牧、水产等养殖领域，为“无抗养殖”提供更优越的解决方法。
[0004]抗菌肽EJ97是一种来源于粪肠球菌的非羊毛硫细菌素，属于无前导细菌素。其遗传结构简单，易于在益生菌中表达，便于规模化生产，能够有效抑制养殖中常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。其抑菌谱范围较窄因此较少影响与宿主共生的微生物，能够维持肠道菌群平衡。抗菌肽EJ97具有优良的热稳定性，可以在经过较高杀菌环境后依然发挥作用，在较低温度的加工储运环境下保持结构稳定；并且EJ97盐离子稳定性较好，在盐含量较高的环境中依然可以保持活性；对蛋白酶类比较敏感。抗菌肽EJ97应用在饲料添加剂中具有广阔前景和独特优势。但是抗菌肽EJ97也存在对革兰氏阴性菌抑制活性较低的缺陷，因此将抗菌肽EJ97改良后，专利技术其大规模工业化生产制备方法有望降低生产成本，推动其在饲料及添加剂方面的应用。
[0005]异源表达是一种常用的工业化生产方式，常见的宿主工程菌株如毕赤酵母等在发酵生产前需要添加甲醇等诱导剂，而里氏木霉不仅安全无害，而且本身具有强启动子、类哺乳动物的蛋白修饰能力和高效的合成分泌机制等优点，在规模发酵方面独居优势。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种以里氏木霉Tu6为工程宿主菌的重组抗菌肽E
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EJ97的制备方法及其抗菌特性的相关应用。
[0007]本专利技术基于下述技术方案予以实现：
[0008]一种重组抗菌肽E
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EJ97，所述重组抗菌肽E
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EJ97的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3是在原始氨基酸序列SEQ ID NO.2的抗菌肽EJ97基础上，翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成，对该人工合成的片段进行易错PCR反应获得的突变体。
[0010]SEQ ID NO.1MLAKIRVMIKRFPNPYTIAVKLTTYELNWYKQQYGKYPWERPVA
[0011]SEQ ID NO.2：MLAKIKAMIKKFPNPYTLAAKLTTYEINWYKQQYGRYPWERPVA
[0012]SEQ ID NO.3：atgttggctaagattgtttaaatgattaaggtttttcctaacccttacactattgcttaaaagttgactacttacgaattgaactggtacaagcaacaatacggtagatacaagtgggaaagacctgttgcttaataa
[0013]本专利技术提供包含上述抗菌肽基因的里氏木霉重组表达载体。
[0014]本专利技术涉及可表达上述抗菌肽E
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EJ97的重组里氏木霉Tu6工程菌。
[0015]本专利技术包含一种重组抗菌肽E
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EJ97的制备方法，具体为：通过易错PCR反应扩增抗菌肽EJ97的基因片段，使用琼脂糖凝胶电泳检测该PCR片段，通过体外同源重组插入里氏木霉表达载体，构建重组抗菌肽E
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EJ97的重组表达载体，转化到大肠杆菌DH5α；将重组表达载体采用聚乙二醇介导的原生质体转化法转入到里氏木霉Tu6，经过筛选阳性转化子及验证，通过发酵表达获得重组抗菌肽E
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EJ97。
[0016]本专利技术涉及一种重组抗菌肽E
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EJ97在制备饲料或饲料添加剂中的应用。
[0017]本专利技术与现有技术相比的有益效果：
[0018]本专利技术通过易错PCR方法得到了一种重组抗菌肽E
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EJ97，构建其在里氏木霉中的重组表达载体突变库。本专利技术表征了重组抗菌肽E
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EJ97的抗菌活性，其对大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌均有抑制作用。对于已有报道原序列抗菌肽，EJ97对大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌的抗菌活性极弱，而本专利技术的重组抗菌肽E
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EJ97大肠杆菌和沙门氏菌均能有较好的抑制作用。
[0019]本专利技术所述的重组抗菌肽E
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EJ97具有良好的热稳定性、盐离子稳定性。
[0020]本专利技术所述的重组抗菌肽E
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EJ97的胃蛋白酶和胰蛋白酶稳定性得到提升。
[0021]上述特性有利于其在饲料及饲料添加剂中的应用。
附图说明
[0022]图1为重组抗菌肽的基因扩增核酸电泳示意图；
[0023]图2为重组表达载体的构建示意图；
[0024]图3为重组抗菌肽E
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EJ97热稳定性示意图；
[0025]图4为重组抗菌肽E
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EJ97的胃蛋白酶稳定性示意图；
[0026]图5为重组抗菌肽E
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EJ97的胰蛋白酶稳定性示意图。
具体实施方式
[0027]实施例1重组抗菌肽E
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EJ97基因的易错PCR
[0028]以NCBI中CAD35293.1公布的EJ97的氨基酸序列为原始氨基酸序列，使用SnapGene 3.2.1软件将其翻译为核苷酸序列，进行人工合成。以合成的核苷酸序列为模板，进行易错
PCR反应制备E
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EJ97核苷酸片段。使用的PCR扩增酶为高保真扩增酶，PCR反应体系(50μL)为：Buffer 25μL；dNTP 1μL；0.5μL；pf 2μL；pr 2μL；合成模板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组抗菌肽E
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EJ97，其特征在于所述重组抗菌肽E
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EJ97的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体含权利要求1所述重组抗菌肽E
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EJ97的基因SEQ ID NO.3。3.一种重组里氏木霉Tu6工程菌，其特征在于所述工程菌为能够表达权利要求1所述重组抗菌肽E
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EJ97。4.一种重组抗菌肽E
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E...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，梁青平，赵迎军，刘哲民，
申请(专利权)人：威海迪普森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：