【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体地，涉及一种nk细胞的扩增方法。
技术介绍
1、t细胞一直处于免疫治疗研究的前沿，尽管基于t细胞的免疫疗法成功应用于癌症的范围很广，但总的来说，只有一小部分患者得到了持久的改善。nk细胞是属于先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，以其能自动识别和杀死感染或恶性的细胞而闻名。nk细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化和发育依赖骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝脏、脾脏、肺和淋巴结。不像t细胞需要mhc分子呈递肿瘤新抗原，nk细胞通过其表面的一系列活化性受体和抑制性受体之间的动态平衡触发自身活性，识别在应激癌细胞上上调的生殖系编码的配体，从而启动杀伤靶细胞的过程。nk细胞可以直接杀死那些低突变负荷或缺乏新抗原提呈的癌细胞，是机体对抗病原体和肿瘤细胞的第一道防线。nk细胞活化后能与靶细胞之间形成突触，释放穿孔素和颗粒酶裂解靶细胞，还可通过fas和fasl的相互作用、tnf和tnfr的结合、ifnγ的分泌等促进对靶细胞的杀伤。nk细胞可以通过分泌效应细胞因子，影响适应性免疫应答的功能。因此，nk细胞可以潜在地对抗那些对t细胞疗法无效的癌症，理论上更广泛的癌症类型可能对nk细胞治疗有反应。目前，以nk细胞为主导的细胞治疗是同种异体nk细胞的过继性转移。过继性nk细胞转移相对安全，移植物抗宿主病或细胞因子释放综合征(crs)的风险较低。因此，nk细胞对肿瘤患者的治疗有很大的前景，这也使各个研究机构致力于推进以nk细胞为基础的免疫疗法。
2、人nk细胞约占外周血淋巴细胞的5％～25％，脐血中的nk细胞比例
技术实现思路
1、本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种nk细胞的扩增方法，提高扩增的nk细胞活性。
2、本专利技术采取的技术方案是，一种nk细胞的扩增方法，包括以下步骤：
3、s1、从血液中批量分离提取血浆和单个核细胞，将血浆冻存，将单个核细胞配制成细胞悬液；
4、s2、将步骤s1中的细胞悬液在培养箱中静息培养，将单个核细胞冻存；
5、s3、复溶步骤s1中冻存的血浆，复苏步骤s2中冻存的单个核细胞，在基础培养基中加入血浆，对单个核细胞进行静息培养；
6、s4、将步骤s3中静息培养后的的单个核细胞用激活培养基培养，得到激活的单个核细胞；所述激活培养基为所述基础培养基添加重组人cd48/slamf2蛋白获得；
7、s5、将激活后的单个核细胞用活化培养基进行培养，得到活化的nk细胞；
8、s6、将活化后的nk细胞用扩增培养基进行培养，得到扩增后的nk细胞。
9、所述血液样品来源是外周血或脐血。若是有产品需要立即培养，则在步骤s1中，无需将血浆冻存，且经过步骤s1后直接进行步骤s3的处理。步骤s2中静息培养的时间为12～24小时。
10、本方案中通过冻存前和复苏后两次静息培养处理，提高细胞活性。且通过复苏并静息处理后，通过cd48/slamf2刺激nk细胞，再通活化培养基活化并扩增nk细胞，此过程不用提前包被，简化流程，并减少功能蛋白和单抗的使用量，减少成本。另外，在本专利技术的一个以上实施例中，对30ml以上的外周血来源或10ml以上脐血来源的单个核细胞进行诱导培养，培养时间14～16天，即可收获总细胞数达50～100亿，cd3-cd56+比例在80％～99％之间的终产品，nk细胞纯度高，培养时间短，缩减了培养基和细胞因子的使用成本。
11、进一步地，所述步骤s2具体为：将步骤s1中的细胞悬液稀释至2～5×106/ml，放入培养瓶中置于36～37℃，4％～6％c02的培养箱静息培养，200～300g离心5～10分钟收集细胞悬液，将细胞冻存液预冷至3～5℃，所述细胞冻存液含10％dmso和10～50％自体血浆，将所述细胞悬液用预冷后的细胞冻存液重悬，在-70～-90℃下冷冻，放入液氮中保存。
12、在本技术方案中，所述静息培养的时间为12～24小时，在-70～-90℃下冷冻的时间为12～48小时。
13、进一步地，所述步骤s3具体为：将步骤s1冻存的血浆在2～8℃的温度下复溶，将步骤s2中冻存的细胞在37～40℃水浴复苏，加入36～37℃预温的基础培养基中，200～300g离心5～10分钟，弃上清，分散，用基础培养基混匀，混匀过程中吸取少量计数，用基础培养基将细胞悬液稀释至密度为2～5×106个/ml，接种于培养容器中,放入36～37℃、4～6％co2培养箱中培养18～24小时。
14、在本技术方案，将步骤s1冻存的血浆在2～8℃的温度下复溶的时间为12～24小时，
15、进一步地，所述步骤s4具体为：收集经过步骤s3处理后的细胞悬液，200～300g离心5～10分钟，弃上清，用36～37℃预温的激活培养基重悬，调整细胞密度为2～3×106/ml，转移至培养容器中，诱导培养4～12小时。
16、在本专利技术的一个以上实施例中，经过细胞悬液经过激活培养基诱导培养之后，已经得到高纯度的nk细胞。
17、进一步地，所述步骤s5具体为：在步骤s4得到的细胞悬液中补加等体积的活化培养基，诱导培养2～3天，所述活化培养基含5～10％自体血浆；补加1～2倍体积的含2.5～5％自体血浆的活化培养基，诱导培养2～3天；补加含1～2.5％自体血浆的活化培养基，诱导培养1～2天，保持细胞密度在0.5～3×106/ml。
18、在本专利技术的一个以上实施例中，活化培养基培养细胞悬液总共为5～8天，让nk细胞形成占比70％以上的优势细胞群，淘汰大部分非nk细胞。
19、进一步地，所述步骤s6具体为：将步骤s5得到的细胞悬液补加的扩增培养基进行培养，保持总细胞密度在0.5～3×106/ml，所述扩增培养基含1％自体血浆；每间隔2天，添加含1％的自体血浆的扩增培养基进行nk细胞诱导扩增，保持细胞浓度为0.5～3×106/ml；使用扩增培养基培养7～9天，收取nk细胞。
20、在本专利技术一个以上的实施例中，细胞悬液经过扩增培养基的培养之后，获得大量纯度在90％以上的nk细胞。
21、进一步地，所述基础培养基为淋巴细胞无血清培养基l500、aim-v、x-vivo 15或gtt551。优选为aim-v。
22、进一步地，所述激活培养基为所述基础培养基添加重组人cd48/slamf2蛋白，重组人cd48/slamf2蛋白的工作浓度为50～100ng/ml，优选为100ng/ml；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将步骤S1中的细胞悬液稀释至2～5×106/ml，放入培养瓶中置于36～37℃，4％～6％C02的培养箱静息培养，200～300g离心5～10分钟收集细胞悬液，将细胞冻存液预冷至3～5℃，所述细胞冻存液含10％DMSO和10～50％自体血浆，用预冷后的细胞冻存液将所述细胞悬液重悬，在-70～-90℃下冷冻，放入液氮中保存。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：将步骤S1冻存的血浆在2～8℃的温度下复溶，将步骤S2中冻存的细胞在37～40℃水浴复苏，加入36～37℃预温的基础培养基中，200～300g离心5～10分钟，弃上清，分散，用基础培养基混匀，混匀过程中吸取少量计数，用基础培养基将细胞悬液稀释至密度为2～5×106个/mL，接种于培养容器中,放入36～37℃、4～6％CO2培养箱中培养18～24小时。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤S4具
5.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤S5具体为：在步骤S4得到的细胞悬液中补加等体积的活化培养基，诱导培养2～3天，所述活化培养基含5～10％自体血浆；补加1～2倍体积的含2.5～5％自体血浆的活化培养基，诱导培养2～3天；补加含1～2.5％自体血浆的活化培养基，诱导培养1～2天，保持细胞密度在0.5～3×106/mL。
6.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤S6具体为：将步骤S5得到的细胞悬液补加扩增培养基进行培养，保持总细胞密度在0.5～3×106/mL，所述扩增培养基含1％自体血浆；每间隔2天，添加含1％的自体血浆的扩增培养基进行NK细胞诱导扩增，保持细胞浓度为0.5～3×106/mL；使用扩增培养基培养7～9天，收取NK细胞。
7.根据权利要求1～6任一所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述基础培养基为淋巴细胞无血清培养基L500、AIM-V、X-VIVO 15或GTT551。
8.根据权利要求1～6任一所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述重组人CD48/SLAMF2蛋白的工作浓度为50～100ng/ml；所述激活培养基重悬单个核细胞的细胞密度为1～4×106/mL，所述激活培养基激活细胞悬液的时间为4～12小时。
9.根据权利要求1～6任一所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述活化培养基为所述基础培养基添加50～200ng/ml CD16mAb、2～10ng/ml IL-12、2～10ng/ml IL-15、2～10ng/ml IL-18和2～10ng/ml IL-21。
10.根据权利要求1～6任一所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述扩增培养基为所述基础培养基加500～2000IU/ml IL-2、2～10ng/ml IL-12、2～10ng/ml IL-15、2～10ng/ml IL-18和2～10ng/ml IL-21。
...【技术特征摘要】
1.一种nk细胞的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的nk细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：将步骤s1中的细胞悬液稀释至2～5×106/ml，放入培养瓶中置于36～37℃，4％～6％c02的培养箱静息培养，200～300g离心5～10分钟收集细胞悬液，将细胞冻存液预冷至3～5℃，所述细胞冻存液含10％dmso和10～50％自体血浆，用预冷后的细胞冻存液将所述细胞悬液重悬，在-70～-90℃下冷冻，放入液氮中保存。
3.根据权利要求1所述的nk细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤s3具体为：将步骤s1冻存的血浆在2～8℃的温度下复溶，将步骤s2中冻存的细胞在37～40℃水浴复苏，加入36～37℃预温的基础培养基中，200～300g离心5～10分钟，弃上清，分散，用基础培养基混匀，混匀过程中吸取少量计数，用基础培养基将细胞悬液稀释至密度为2～5×106个/ml，接种于培养容器中,放入36～37℃、4～6％co2培养箱中培养18～24小时。
4.根据权利要求1所述的nk细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤s4具体为：收集经过步骤s3处理后的细胞悬液，200～300g离心5～10分钟，弃上清，用36～37℃预温的激活培养基重悬，调整细胞密度为2～3×106/ml，转移至培养容器中，诱导培养4～12小时。
5.根据权利要求1所述的nk细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤s5具体为：在步骤s4得到的细胞悬液中补加等体积的活化培养基，诱导培养2～3天，所述活化培养基含5～10％自体血浆；补加1～2倍体积的含2.5～5％自体血浆的活化培养基，诱导培养2～3...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄松音，苏鸿君，杨洁文，姚燕丹，刘典典，林帝金，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。