【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工，尤其是一种实现高纯度不饱和透明质酸二糖的制备方法。
技术介绍
1、透明质酸(hyaluronic acid,ha)，又称为玻尿酸，是一种以d葡萄糖醛酸(gicuac)和n-乙酰-d葡萄糖胺(gicnac)二糖为单元聚合而成的酸性粘多糖。透明质酸根据分子量的范围，可分为大分子、中分子、小分子和寡聚透明质酸四种类别，而不同分子量的透明质酸物理学及生物学表现特性不同。分子量较大的透明质酸，具有更强的支撑性、抗降性和黏弹性，因此常作为塑形填充材料应用于医疗美容中。分子量较小的透明质酸，能够穿透表皮实现皮肤深层吸收，因此常用于保湿类的护肤品中。
2、其中，寡聚透明质酸的分子量在10kda以下，能够抑制皮肤细胞氧化损伤、修复紫外损伤细胞、降低细胞内活性氧自由基和治疗癌症，具有重要的功能。因为传统物理方法很难将ha的分子量降解到10kda以下，而化学方法对糖链上的基团进行某种修饰，可能会造成ha生物活性的丧失，因此目前透明质酸寡糖的获得只适宜酶法制备。目前不饱和透明质酸二糖通过微生物来源的透明质酸裂解酶以β-消除机制降解透明质酸成4,5-不饱和二糖制备。已有实验研究表明不饱和二糖具有较强的抗皮肤氧化作用，并且能够明显促进人脐静脉内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖，在医药领域具有广阔的应用前景。另外，高纯度不饱和透明质酸二糖(δdiha)也可以作为标准品，用作透明质酸及其相关产品的含量及纯度检测。
3、目前专利公开文献cn110982862a公开了一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法，该专利技术
4、另一篇专利公开文献cn116218941a公布了一种低成本、高效制备透明质酸不饱和二糖的方法，该专利技术采用的是将含有透明质酸裂解酶基因的重组乳酸克鲁维酵母菌株和产透明质酸的兽疫链球菌株的发酵液混合到一起，然后进行混菌发酵，发酵结束后可直接得到含不饱和透明质酸二糖的发酵液，接着混菌发酵液需经过陶瓷膜过滤、5kda超滤膜超滤、纳滤膜脱盐浓缩，再经活性炭吸附脱色，最后采用喷雾干燥塔干燥后，即可得到不饱和透明质酸二糖固体。该专利技术的创新点在于利用一步混菌发酵即可直接得到不饱和透明质酸二糖，且产量可达到35g/l，但该专利技术发酵结束后的操作工艺流程太繁琐，工艺成本太高，利用了太多的膜技术操作，且其中的陶瓷膜材料价格昂贵，纳滤膜材料存储环境要求高、清洗条件严格，尤其是最后采用的喷雾干燥塔干燥，生产成本不仅较高，所需热能耗较大，能源效率较低，喷雾干燥的热风温度达到180～220℃，而不饱和透明质酸二糖因含有c4＝c5不饱和键，在较高的温度下该键会发生断裂，进而影响二糖的产率。
5、专利cn114901701a公布了一种超低分子量透明质酸及其制备方法，该专利技术利用大分子透明质酸为原料，经过透明质酸酶水解、加热灭活、活性炭过滤及喷雾干燥等生产工艺，得到平均分子量低于1200道尔顿的超低分子量透明质酸产物。其为透明质酸二糖至十二糖的混合物，主要为透明质酸四糖和六糖，而透明质酸二糖含量仅占比为5-10％，二糖的产率较低且纯度也较低。
6、通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种实现高纯度不饱和透明质酸二糖的制备方法。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种实现高纯度不饱和透明质酸二糖的制备方法，包括以下步骤：
4、⑴用0.2m的磷酸缓冲液配制1～5g/l的高分子透明质酸底物溶液；
5、⑵用相同磷酸缓冲液配制透明质酸酶液，单位酶活在2000u/ml-4000u/ml；
6、⑶按照体积比2:3分别加入底物溶液和酶液配置反应体系，在37℃条件下进行酶解；酶解2h后继续添加等量的酶液，接着继续反应2h，再继续添加等量酶液，进行反应2h，当总反应6h后进行终止反应；
7、⑷将步骤⑶中总反应6h的反应液进行加热煮沸5min终止反应，得酶解液；步骤⑷中的加热煮沸时间不可过长，这是由于产物不饱和透明质酸二糖在c4＝c5之间含有不饱和双键，加热过久会导致其分解，进而影响产物的实际得率。
8、⑸将步骤⑷中的酶解液12000r/min进行离心5min，取上清；步骤⑸中的离心的目的是为了除去反应液中不可溶杂志以及部分失活变性酶蛋白。
9、⑹将步骤⑸中的上清液进行超滤获得超滤液，接着经0.22um的滤膜进行hplc检测分析；步骤⑹中的超滤的目的是为除去酶蛋白以及杂蛋白，让目标产物纯度更高，同时该所述步骤中进行液相检测时的对照品采用的是购买于上海甄准生物科技公司的分析对照品δdiha。
10、⑺将步骤⑹中的超滤液在50℃、200r/min的条件下进行旋转蒸发得到浓缩液；
11、⑻将步骤⑺中浓缩液先预冷后放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，设定温度为-80℃，真空度下降到20pa以下，冷冻时间为12h，制备成粉末，得高纯度不饱和透明质酸二糖。
12、进一步地，步骤⑴中高分子透明质酸底物溶液的底物为高分子量的透明质酸，其分子量在2000-2800kda；同时底物配制过程为向缓冲液中加入称量好的透明质酸，将其放在37℃，200rpm下溶解2h，放于4℃下静置过夜待用。
13、进一步地，所述磷酸缓冲液的浓度为0.2m、ph在5.5-6.5的nah2po4-na2hpo4磷酸缓冲液。
14、进一步地，步骤⑵中透明质酸酶液中的酶液为专利公开文献202310006533.x中的链霉菌来源的透明质酸裂解酶，该酶具有较宽的ph范围，且该酶均有较高的热稳定性。
15、进一步地，步骤⑹中的hplc液相检测条件为：
16、检测色谱柱：aminex hpx-87p column，300x7.8mm的氨基柱、流动相：5mm h2so4水溶液、进样体积：20ul、流速：0.6ml/min、检测波长：232nm。
17、进一步地，步骤⑹中超滤的条件为：4℃，4000r/min，30min，且使用孔径10kda的超滤管进行超滤。
18、进一步地，所述透明质酸酶液中的透明质酸酶的制备步骤为：
19、⑴从-80℃保存的产透明质酸酶的链霉菌工程菌株接种于ms固体平板或含有抗性的ms平板，根据需要添加抗性培养菌株，固体培养7天以上至产孢良好；
20、⑵用无菌棉签蘸取无菌水轻轻刮取ms固体平板上的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种实现高纯度不饱和透明质酸二糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑴中高分子透明质酸底物溶液的底物为高分子量的透明质酸，其分子量在2000-2800KDa；同时底物配制过程为向缓冲液中加入称量好的透明质酸，将其放在37℃，200rpm下溶解2h，放于4℃下静置过夜待用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸缓冲液的浓度为0.2M、pH在5.5-6.5的NaH2PO4-Na2HPO4磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑵中透明质酸酶液中的酶液为专利公开文献202310006533.X中的链霉菌来源的透明质酸裂解酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑸中的上清液进行超滤获得超滤液，接着经0.22um的滤膜进行HPLC检测分析，HPLC液相检测条件为：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑹中超滤的条件为：4℃，4000r/mi n，30min，且使用孔径10KDa的超滤管进行超滤。
7.根据权利要
...【技术特征摘要】
1.一种实现高纯度不饱和透明质酸二糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑴中高分子透明质酸底物溶液的底物为高分子量的透明质酸，其分子量在2000-2800kda；同时底物配制过程为向缓冲液中加入称量好的透明质酸，将其放在37℃，200rpm下溶解2h，放于4℃下静置过夜待用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸缓冲液的浓度为0.2m、ph在5.5-6.5的nah2po4-na2hpo4磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特...
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