【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及新德里番茄曲叶病毒tolcndv侵染性克隆重组载体，属于生物。
技术介绍
1、新德里番茄曲叶病毒(tolcndv)是双生植物真菌病毒目(geplafuvirales)、双生病毒科(geminiviridea)、菜豆金色黄花叶病毒属(begomovirus)成员，目前是我国瓜类病毒中为害最为严重的一种，能够导致毁产，亟待筛选和培育抗病毒品种来进行防控。
2、双生病毒通过烟粉虱进行传毒，所以在抗病毒品种筛选和培育过程中需要构建它们的侵染性克隆来提高接种效率。由于该类病毒实行滚环复制，想要获得该类病毒的侵染性克隆，必须将病毒的一个完整基因组与至少包含ir区的基因组区域进行串联，克隆方可具有侵染性，这就意味着克隆必须包含一部分重复序列。理论上讲，构建该类病毒的侵染性克隆只能使用传统的酶切连接的方法分段分步进行。
3、另外，考虑到双生病毒的基因组大多含有2条单链环状dna(dna-a和dna-b)，这意味着大部分双生病毒的侵染性克隆其实是由两个克隆组成，在实际的接种应用中，人们需将含有这两个克隆的农杆菌分别培养、诱导，并对菌浓度进行调整，以保证二者能够按照1:1比例进行混合使用，操作较为繁琐。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种新德里番茄曲叶病毒tolcndv侵染性克隆重组载体，该重组载体含有tolcndv基因组中的2条单链环状dna，经过培养诱导后可直接用于接种，简化了tolcndv侵染瓜类作物的实验操作步骤，所涉及的侵染性克隆可以
2、为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：一种新德里番茄曲叶病毒tolcndv侵染性克隆重组载体，所述重组载体含有tolcndv基因组中的2条单链环状dna，2条单链环状dna分别为dna-a与dna-b；所述病毒tolcndv能够侵染瓜类作物的病毒。
3、进一步，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
4、s1、提取植物基因组：从感染新德里番茄卷叶病毒的甜瓜叶片中提取基因组dna；
5、s2、设计引物：根据病毒基因组和植物表达载体pcambia1300的序列信息，基于dna-a与dna-b分别与载体共有单一酶切位点sac i与kpn i，设计7条引物：a-1555f、a-367r、a-362f、b-2060f、b-2025r、b-1520f和b-518r，7条引物的序列分别为：
6、a-1555f：5＇-taaaacgacggccagtgccaagcttgaccggaatagagtggttct-3＇
7、a-367r：5＇-tgaccatgattacgaattcgagctccataggggctgtcgaagttg-3＇
8、a-362f：5＇-attagagctcgtgcagttgtccccattg-3＇
9、b-2060f：5＇-tgaccatgattacgaattcgagctctgcagcatcgtttgtgag-3＇
10、b-2025r：5＇-taaaacgacggccagtgccaagcttagccagttgagaaatag-3＇
11、b-1520f：5＇-cgttcggacctatagccag-3＇
12、b-518r：5＇-cttgagctcttgtttccgttgtacgt-3＇。；
13、s3、提取质粒：以基因组dna为模板、分别以a-1555f/a-367r、a-362f/a-367r为引物进行pcr扩增，pcr扩增产物分别经hindiii/sac i、sac i进行酶切处理，获得的两个片段直接与经hind iii和sac i双酶切处理的pcambia1300载体进行连接，获得ptolcndv-1.57a；
14、以基因组dna为模板、分别以b-2060f/b-2025r、b-1520f/b-518r为引物进行pcr扩增，pcr扩增产物分别经pst i/kpn i、kpn i/sac i进行酶切处理，获得的两个片段直接与经pst i和sac i双酶切处理的pcambia1300载体进行三片段连接，获得ptolcndv-1.43b；
15、s4、设计特异性同源重组引物：为避免病毒重复序列发生重组、丢失，根据步骤s3中ptolcndv-1.57a和ptolcndv-1.43b的序列信息，设计2条包含载体和病毒序列的特异性同源重组引物1.43bf和1.43br，特异性同源重组引物1.4bf和1.4br的序列分别为：
16、1.4bf：5＇-aaccactctattccggtcaagcttaattcgagctcttgtttccgtt-3＇
17、1.4br：5＇-acgacggccagtgccaagctt-3＇。；
18、s5、pcr扩增：以1.43bf/1.43br为引物、以ptolcndv-1.43b的序列为模板进行pcr扩增，获得长度为3888bp的pcr片段；
19、s6、重组完成构建：将步骤s5获得的pcr片段与步骤s3中经hindiii酶切处理的ptolcndv-1.57a进行同源重组、转化和筛选，获得同时含有tolcndv两条基因组的侵染性克隆重组载体ptolcndv-hm6。
20、上述重组载体的重组体，所述重组体的宿主细胞为含有ptolcndv-hm6的重组载体的农杆菌gv3101。
21、上述重组载体侵染瓜类作物的方法，包括以下步骤：
22、步骤1、采用液氮冻融法将含有ptolcndv-hm6的重组载体转入农杆菌菌株gv3101中；
23、步骤2、将含有重组载体ptolcndv-hm6的农杆菌进行培养和诱导，用注射器将其接种于植株叶片；
24、步骤3、接种植株置于温室中培养，接种三周后进行症状的观察和侵染性的检测。
25、采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本专利技术通过分析tolcndv基因组单一酶切位点及植物表达载体多酶切位点，巧妙的将含有病毒重复序列的两个片段利用病毒基因组单一酶切位点进行自连、又通过外源添加酶切位点的方式将其定向克隆至植物表达载体中，从而一步获得该病毒的侵染性克隆，该法省时省力，可广泛应用于双生病毒侵染性克隆的构建。
26、本专利技术通过分析tolcndv两条基因组的侵染性克隆序列，针对其中一个克隆设计包含载体和病毒序列的特异性引物，用来扩增克隆中所包含的整个病毒序列，避免重复序列的丢失，之后将其插入到另一个克隆中，以获得同时含有两条基因组的病毒侵染性克隆。该克隆经过培养诱导后可直接用于接种，既简化了接种流程，也保证了接种时病毒的两条基因组以绝对的相同比例进入植物体内，提高了接种效率。
27、本专利技术的重组载体含有tolcndv基因组中的2条单链环状dna，经过培养诱导后可直接用于接种，简化了tolcndv侵染瓜类作物的实验操作步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.新德里番茄曲叶病毒ToLCNDV侵染性克隆重组载体，其特征在于，所述重组载体含有ToLCNDV基因组中的2条单链环状DNA，2条单链环状DNA分别为DNA-A与DNA-B。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，步骤S2中的7条引物的序列分别为：
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述步骤S4特异性同源重组引物1.4BF和1.4BR的序列分别为：
5.含有权利要求2-4任一项所述重组载体的重组体，其特征在于：所述重组体的宿主细胞为含有pTOLCNDV-HM6的重组载体的农杆菌GV3101。
6.使用权利要求2-4任一项所述重组载体侵染瓜类作物的方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.新德里番茄曲叶病毒tolcndv侵染性克隆重组载体，其特征在于，所述重组载体含有tolcndv基因组中的2条单链环状dna，2条单链环状dna分别为dna-a与dna-b。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，步骤s2中的7条引物的序列分别为：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘莉铭，古勤生，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：
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