一种产生2制造技术

本发明专利技术提供了一种产生2

【技术实现步骤摘要】
一种产生2
’‑
岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌及其应用


[0001]本专利技术遗传工程
，尤其是指一种产生2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]母乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是人乳中一类非单一结构、非消化性碳水化合物的总称，对婴幼儿的健康及生长发育具有重要作用，已被用作婴儿配方食品的功能性成分。2
’‑
岩藻糖基乳糖 (2
’‑
Fucosyllactose，2
’‑
FL)是母乳寡糖中含量最多的一种，约占总母乳寡糖的1/3，是目前最具有潜力的一种母乳寡糖。2
’‑
岩藻糖基乳糖具有调节肠道菌群、抵抗病原菌的黏附、免疫调节及促进神经系统发育和修复等多种功能，已被多个国家或地区批准作为婴儿配方奶粉的添加剂，具有较大的应用价值和市场需求。2
’‑
FL可通过α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶，以GDP
‑
L
‑
岩藻糖 (GDP
‑
L
‑
fucose，GDP
‑
L
‑
Fuc)和乳糖为底物合成。
[0003]目前，2
’‑
岩藻糖基乳糖的生产方法主要有化学合成法、酶催化合成法和生物合成法。2019年，丹麦GlycomA/S公司发表了利用化学合成法生产公斤级2
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岩藻糖基乳糖的技术方案。该方案以L
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岩藻糖为底物经三步化学反应可获得高纯度2
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岩藻糖基乳糖。但化学法需要使用大量的有机试剂且反应条件苛刻，使用L
‑
岩藻糖为底物所生产的2
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岩藻糖基乳糖成本较高且总的产物得率较低。酶催化合成法常涉及糖基转移酶和糖苷水解酶两类酶。糖基转移酶可将单糖分子从其核苷酸糖基供体转移至相应的受体上。糖基转移酶的主要缺点是稳定性低、不易获得，且需要使用昂贵的核苷酸糖基为供体。糖苷水解酶一般用于催化糖苷键的水解反应，在特定条件下也可以催化活化糖基供体的转糖苷反应来合成糖苷键。由于合成的产物会被进一步水解，转糖苷反应产物的得率一般低于40％
‑
50％。利用糖苷水解酶催化合成2
’‑ꢀ
岩藻糖基乳糖需要4
‑
对硝基苯
‑
α
‑
L
‑
岩藻糖苷(pNP
‑
FUC)作为糖基供体，该底物的缺点是反应产物中含有对硝基苯酚(pNP)，不适用于食品领域，且成本也较高。生物合成法生产2
’‑
岩藻糖基乳糖基于微生物内源或异源的代谢途径合成GDP
‑
岩藻糖，经α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶催化合成2
’‑
岩藻糖基乳糖。目前已知的胞内GDP
‑
岩藻糖的生物合成途径有两种：从头合成途径 (de novo pathway)和补救合成途径(salvagepathway)。生物合成法是目前工业上生产2
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岩藻糖基乳糖的主要方法。补救合成途径使用L
‑
岩藻糖为底物，相较于从头合成途径可以使用廉价碳源(葡萄糖、蔗糖等)为底物进行 2
’‑
岩藻糖基乳糖合成，生产成本较高，工业应用价值较低。目前，利用微生物从头合成途径已经开发了大肠杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒杆菌等2
’‑
岩藻糖基乳糖生产方法。
[0004]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种常见的肠道益生菌，能够有效阻止病原菌在肠道内定殖。枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉进行生长和繁殖。由于枯草芽孢杆菌的安全性，已被美国食品药品管理局(FDA) 认定为GRAS(Generally recognized as safe)菌株。目前，枯草芽孢杆菌已被开发利用GDP
‑
L
‑
岩藻糖补救合成途径进行2
’‑
岩藻糖基乳糖的生产。在枯草芽孢杆菌中利用补救途径生产2
’‑
岩藻糖基乳糖可以发挥枯草芽
NO.17
‑
SEQ ID NO.26所示。
[0010]本专利技术的第二个目的在于提供构建所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
[0011]S1：分别将甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因manA、磷酸甘露糖变位酶基因 manB、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因manC、GDP
‑
甘露糖脱水酶基因gmd、 GDP
‑
岩藻糖合酶基因wcaG和α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因futC的表达框，及β
‑ꢀ
半乳糖苷酶基因yesZ和ganA的敲除框，及基因同源片段连接至基因编辑载体上。
[0012]S2：依次将S1中所得基因编辑载体转化至枯草芽孢杆菌中，得到所述重组枯草芽孢杆菌。
[0013]进一步的，构建由甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因manA、组成型启动子片段及整合位点上下游同源臂组成的整合片段，用于整合甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因，所述甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述组成型启动子片段为SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.26中任何一个启动子序列，所述甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
[0014]进一步的，构建由磷酸甘露糖变位酶基因manB、组成型启动子片段及整合位点上下游同源臂组成的整合片段，用于整合磷酸甘露糖变位酶基因，所述磷酸甘露糖变位酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述组成型启动子片段为SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.26中任何一个启动子序列，所述磷酸甘露糖变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
[0015]进一步的，构建由甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因manC、组成型启动子片段及整合位点上下游同源臂组成的整合片段，用于整合甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因，所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.5 所示，所述组成型启动子片段为SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.26中任何一个启动子序列，所述磷酸甘露糖变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6。
[0016]进一步的，构建由GDP
‑
甘露糖脱水酶基因gmd、组成型启动子片段及整合位点上下游同源臂组成的整合片段，用于整合GDP
‑
甘露糖脱水酶基因，所述GDP...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌为出发菌株，将甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因manA、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因manC、GDP
‑
甘露糖脱水酶基因gmd、GDP
‑
岩藻糖合酶基因wcaG和α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因futC整合枯草芽孢杆菌基因组上，并敲除β
‑
半乳糖苷酶基因yesZ和ganA得到。2.根据权利要求1所述的产生2
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岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因manA的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述磷酸甘露糖变位酶基因manB的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因manC的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示、所述GDP
‑
甘露糖脱水酶基因gmd的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示、所述GDP
‑
岩藻糖合酶基因wcaG的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因futC的DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述β
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半乳糖苷酶基因yesZ的原始DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；β
‑
半乳糖苷酶基因ganA的原始DNA序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。3.根据权利要求1所述的产生2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌ATCC6051、枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800。4.根据权利要求1所述的产生2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述甘露糖
‑6‑
磷酸异构酶基因manA、磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷转移酶基因manC、GDP
‑
甘露糖脱水酶基因gmd、GDP
‑
岩藻糖合酶基因wcaG和α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因futC通过组成型启动子控制表达。5.根据权利要求4所述的产生2
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岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述组成型启动子选自启动子P43、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8或P9；所述启动子P43、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9的序列分别如SEQ ID NO.17
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，张权威，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：