一种凝结芽孢杆菌H-1的表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种凝结芽孢杆菌H

【技术实现步骤摘要】
一种凝结芽孢杆菌H
‑
1的表达载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H
‑
1的表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]嗜热凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是芽孢杆菌属的重要成员，是一种革兰氏阳性，兼性厌氧，非致病性，产孢子、产乳酸菌。最佳生长温度为45～60℃，最佳生长pH值6.5～7.0。嗜热凝结芽孢杆菌具有耐热、适合开放式发酵、兼性厌氧、低能耗、高碳代谢速率、高转化率等优势，不仅是重要的益生菌，在工业上也具有重要地位。
[0003]异源表达系统是改造微生物，拓展微生物菌株应用范围的有力工具，已经在生物催化中被广泛的应用，例如精细化工生产、生物先修复和生物脱硫。合适的异源表达系统不仅可以使微生物的菌株改造或者构建变得容易，可以赋予基因工程菌优良的特性，使得利用生物催化剂进行大规模生产更经济可行。目前，只有很少的基因操作工具可以在凝结芽孢杆菌中工作，而且转化效率极低，很难进行操作。这限制了嗜热凝结芽孢杆菌的优良特性在工业和健康领域的应用。
[0004]研究基因的作用的常用方法是删除基因，但更多情况下，删除基因组靶标是不可行或不理想的。因为，有的基因是必需基因，细胞生存必不可少；有的细菌基因操作系统仍未完善建立，没有手段进行敲除，比如凝结芽孢杆菌。基因敲低可以实现中等或有条件的抑制。反义RNA介导的基因沉默技术目前已广泛用作常规工具。在基因治疗，调控细菌基因表达，质粒复制等领域有广泛应用。可以在不改变基因组的前提下对细菌的关键基因进行调控和研究。真核生物中的小RNA(sRNA)可以特异性敲低各种靶细胞中的基因表达，如siRNA和miRNA。sRNA由靶结合序列和Hfq伴侣蛋白组成，与之相比反义RNA可以单独发挥作用，更为便捷简单。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H
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1的表达载体及开发一种可以在凝结芽孢杆菌H
‑
1中应用的反义RNA工具。

技术实现思路

[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H
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1的表达载体及其应用，优化了凝结芽孢杆菌H
‑
1的接合转移方法和转化子验证方法，筛选出了四环素和卡那霉素两种可用抗生素及其工作浓度，使用反义RNA技术敲弱了甲基转移酶的表达，表现了良好的操作性和较高的转化率，远好于目前的电转化的转化方法。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0008]本专利技术的第一个方面是提供一种凝结芽孢杆菌H
‑
1的表达载体，包括来源于载体pNW33N的复制子ori、复制子repB，来源于载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，抗性基因。
[0009]优选地，所述抗性基因为四环素抗性基因Tet
r
，载体命名为pNWMT，所述载体pNWMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]优选地，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因Kan
r
，载体命名为pNWMK，所述载体pNWMK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]进一步，优选地，所述pNWMT载体还包括反义RNA表达模块。
[0012]优选地，所述反义RNA表达模块包括启动子P
ldh1
、限制酶识别位点、反义RNA序列、终止子TB5和终止子rrnB T1。
[0013]进一步，优选地，所述反义RNA序列以甲基转移酶hsdM846为目标基因，载体命名为pNWMTAS，所述载体pNWMTAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]载体pNWMTAS的所述DNA元件，其中复制子ori和复制子repB来自载体pNW33N，四环素抗性基因Tet
r
来自载体pHY300PLK，DNA转移起始位点oriT来自载体pKVM1。反义RNA表达模块来自人工设计合成，其中启动子P
ldh1
来自凝结芽孢杆菌H
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1，反义RNA序列是目标基因起始密码子前30nt的反义序列，终止子TB5来自枯草芽孢杆菌，终止子rrnB T1来自大肠杆菌
[0015]本专利技术的第二个方面是提供所述的表达载体在凝结芽孢杆菌H
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1敲弱基因表达中的应用。
[0016]本专利技术的第三个方面是提供所述表达载体构建方法，包括以下步骤：
[0017]S1从载体pNW33N上PCR扩增出复制子ori和复制子repB片段，从载体pKVM1上PCR扩增出DNA转移起始位点oriT片段，从含有抗性基因的载体上PCR扩增出抗性基因片段；
[0018]S2将复制子ori和复制子repB片段和DNA转移起始位点oriT片段进行融合PCR；
[0019]S3将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段与抗性基因片段使用无缝克隆技术进行连接，即可得到目的载体；
[0020]S4将S3获得的目的载体转化到供体菌，再通过结合转移的方法，将目的载体转化到受体菌嗜热凝结芽孢杆菌H
‑
1中。
[0021]优选地，所述结合转移的方法中，供体菌与受体菌以总OD
600
值以10：1的比例混合。
[0022]优选地，所述供体菌为大肠杆菌S17
‑
1菌株。
[0023]本专利技术具有如下有益效果为：
[0024]1、利用实验室已有的穿梭载体pNW33N，pKVM1，pCas和pHY300PLK中的各元件，使用接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H
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1，构建了可以在大肠杆菌和凝结芽孢杆菌H
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1中自主复制的载体pNWMT和pNWMK。并使用反义RNA表达模块研究了载体的可用性和在反义RNA技术的应用。
[0025]2、以pNWM质粒为基础，探索出高效准确的接合转移转化凝结芽孢杆菌H
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1的方法和转化子的验证方法。在探索可用抗生素抗性基因的过程中，得到了携带四环素抗性基因的pNWMT质粒和携带卡那霉素抗性基因的的pNWMK质粒，摸索出了可以在凝结芽孢杆菌H
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1中正常工作的两种抗生素及其工作浓度。基本完成了凝结芽孢杆菌H
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1的基础基因操作工具。并以反义RNA技术敲弱凝结芽孢杆菌H
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1DNA甲基转移酶hsdM846表达对其生长的影响为实例，考察了所构建载体在反义RNA技术应用中的优势。首先用本专利技术的载体pNWMT构建了对照菌株H1C，用载体pNWMTAS构建了敲弱DNA甲基转移酶hsdM846表达的工程菌H1AS846，使用这两株菌与野生H
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1在活化两代的情况下测量其在50℃条件下的生长情况，发现H1AS846的生长被严重抑制。这表明本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种凝结芽孢杆菌H
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1的表达载体，其特征在于，包括来源于载体pNW33N的复制子ori、复制子repB，来源于载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，抗性基因。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗性基因为四环素抗性基因Tet
r
，载体命名为pNWMT，所述载体pNWMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因Kan
r
，载体命名为pNWMK，所述载体pNWMK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体还包括反义RNA表达模块。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述反义RNA表达模块包括启动子P
ldh1
、限制酶识别位点、反义RNA序列、终止子TB5和终止子rrnB T1。6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述反义RNA序列以甲基转移酶hsdM846为目标基因，载体命名为pNWMTAS，所述载体pNWMTAS的核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶飞，直家辉，孙舒扬，许平，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：