一种胞嘧啶碱基编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种胞嘧啶碱基编辑系统及其应用，胞嘧啶碱基编辑系统包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种胞嘧啶碱基编辑系统及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种胞嘧啶碱基编辑系统及其应用。

技术介绍

[0002]基因编辑是通过在DNA上特定位点引入序列改变，达到基因的敲除、外源DNA片段插入或者DNA碱基突变的技术手段。近年来，CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR
‑
associated proteins)系统在基因编辑中得到了非常广泛的应用，特别是CRISPR/Cas9系统。在该系统中，未成熟的前体CRISPR RNA(pre
‑
crRNA)可以与tracrRNA(trans
‑
activating crRNA)相互结合，并在RNA酶III的作用下形成crRNA:tracrRNA复合物，引导Cas9蛋白识别并切割基因组上的特定位点产生双链断裂；然后，通过同源重组修复(HDR)便可将同源模板上的序列改变引入到基因组的目标靶点上；或者，也可以通过非同源末端连接(NHEJ)的方式直接将断裂的DNA片段进行连接，并产生随机的插入或缺失(Indel)。由于未被修复的双链断裂是致死的，只有成功修复并引入突变使得Cas9不再识别和切割的细胞才能存活下来，这就是利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的基本原理。
[0003]为了简化操作过程并提高编辑效率，常常将crRNA和tracrRNA构建成一个嵌合体即sgRNA(small guide RNA)进行表达，这样只需要表达sgRNA和Cas9蛋白便可进行基因编辑。目前除了CRISPR/Cas9系统以外，CRISPR/Cpf1系统(也被称作CRISPR/Cas12a)也常被应用于基因编辑，与CRISPR/Cas9系统不同的是，CRISPR/Cpf1只需要crRNA便可发挥作用；而且Cpf1自身就具有RNA酶的活力，可以对未成熟的包含多个crRNA的mRNA序列进行切割加工；因此，可以设计一段包含多个crRNA的crRNA阵列，当其被Cpf1加工成熟后，可以产生多个具有独立功能的crRNA并引导Cpf1靶向基因组的对应靶点，实现多个位点的同时编辑。
[0004]很多物种都缺少NHEJ途径，或者即使有活性也较弱，而HDR途径需要同源模板的参与才能发挥作用，且这两种修复机制之间还会存在竞争关系，这都导致基于上述方式的基因编辑过程致死率较高且编辑效率较低。将Cas9的DNA酶进行失活后，可以得到只能切割一条DNA链的nCas9和无法切割DNA的dCas9。nCas9与dCas9仍然可以在sgRNA的引导下结合到基因组的特定位点，但却不会产生致死的双链断裂。胞嘧啶脱氨酶可以催化胞嘧啶(C)脱氨转化为尿嘧啶(U)，并进一步通过DNA修复或复制将U转化为胸腺嘧啶(T)，故将胞嘧啶脱氨酶与nCas9或dCas9进行融合，在sgRNA的引导下便可实现不依赖于双链断裂的基因组碱基编辑(C
→
T)。胞内的尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA N
‑
glycosylase，UNG)可识别错配U
·
G碱基对，并通过碱基错配修复途径(Base excision repair,BER)将编辑产生的U
·
G修复恢复为C
·
G配对，因此还可进一步融合来源于噬菌体PBS的尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)来抑制UNG功能，从而进一步提高碱基编辑的效率。上述融合蛋白(nCas9
‑
CBE或dCas9
‑
CBE)在sgRNA的引导下可以实现基因组上特定位点的C
→
T转化，被称为胞嘧啶碱基编辑系统。
[0005]Cas9所识别的位点需要具有NGG(N＝A,T,C,G)的PAM序列，这限制了基于Cas9的胞嘧啶碱基编辑器在基因组上的可操作范围；此外，引导Cas9的每一个sgRNA都需要完整的转
录单元，在进行多位点碱基编辑时(C
→
T)需要构建多个对应的sgRNA表达框，如此不仅增加了构建过程的复杂性，还会由于启动子等元件的重复使用而降低DNA序列的稳定性。因此，仍需要寻找一种新的胞嘧啶碱基编辑系统。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑系统，克服了基于CRISPR/Cas9的胞嘧啶碱基编辑器在基因组上的可操作范围受限，而且在多位点的碱基编辑(C
→
T)过程中效率低且操作复杂的问题。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种胞嘧啶碱基编辑系统，该胞嘧啶碱基编辑系统包括胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂和DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1形成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1
‑
3所示的序列之一。其中，SEQ ID NO.1为含有hAPOBEC3A的融合蛋白，SEQ ID NO.2为含有hAID的融合蛋白，SEQ ID NO.3为含有LjCDA1L2_1的融合蛋白。
[0008]本专利技术提供了一种融合蛋白，该融合蛋白可识别TTV作为PAM，其中，V＝A,C,G，该融合蛋白的编辑窗口分别在crRNA的第8个碱基到第14个碱基之间、crRNA的第8个碱基到第13个碱基之间或crRNA的第8个碱基到第16个碱基之间将胞嘧啶碱基编辑为胸腺嘧啶，因此该融合蛋白可用于构建胞嘧啶基因编辑器。
[0009]进一步地，胞嘧啶碱基编辑系统还包括crRNA阵列插入区，该crRNA阵列插入区用于插入与DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1匹配的crRNA，即引导DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1剪切编辑特定靶点的crRNA。
[0010]进一步地，crRNA阵列插入区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该crRNA阵列插入区两端包含两个正向重复的crRNA把手序列，并在中间插入了两个反向的Eco31I酶切位点，通过酶切连接便可将所需的识别序列或crRNA阵列放置到两个把手序列之间。
[0011]进一步地，上述胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂和DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1形成的融合蛋白通过诱导型启动子P
grac100
调控表达。
[0012]进一步地，crRNA阵列插入区通过组成型启动子P
veg
调控表达。
[0013]进一步地，上述胞嘧啶碱基编辑系统是将编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1
‑
3所示之一的基因以及crRNA阵列插入区整合到表达载体上得到。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌胞嘧啶碱基编辑系统，该胞嘧啶碱基编辑系统包括：含有枯草芽孢杆菌的温敏型pE194复制子、编码SEQ ID NO.1
‑
3所示序列之一融合蛋白的基因以及上述crRNA阵列插入区的质粒。
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，所述胞嘧啶碱基编辑系统包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示的序列之一的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述胞嘧啶碱基编辑系统还包括crRNA阵列插入区。3.根据权利要求2所述的胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述crRNA阵列插入区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求2所述的胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述crRNA阵列插入区通过组成型启动子P
veg
调控表达。5.根据权利要求1所述的胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述融合蛋白通过诱导型启动子P
grac100
调控表达。6.根据权利要求2所述的胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述胞嘧啶碱基编辑系统通过将编码SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，武耀康，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：