一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法技术

本发明专利技术提供的一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法通过添加抗坏血酸衍生物与白细胞介素因子、肿瘤坏死因子联合顺次使用以持续、稳定的提高间充质干细胞抗炎功能，而不影响细胞增殖、免疫原性，以及后续临床应用的安全性。全性。全性。

【技术实现步骤摘要】
一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法。

技术介绍

[0002]目前行业内用于体外增强MSC抗炎能力的方法主要包括在培养基中添加蛋白因子共培养（例如IFN
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γ、TNFα、IL
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1α/β、IL
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17等）和基因编辑过表达抗炎相关因子等方式，增强抗炎因子分泌以提高抗炎功能。但存在以下难于克服的缺点：1.成本高：蛋白因子生产成本较高，每毫克售价一般都在千元以上，直接影响到细胞制备成本。2. 处理效果不稳定：蛋白因子具有生物活性，保存条件苛刻效期较短，稳定性较差，单独使用容易造成MSC产品批间差异，且处理效果持续性较差。3.免疫原性提高：蛋白因子的处理时间过长会增加MSC 中MHC I和II表达，增加MSC免疫原性，进而增加了MSC移植过程的风险，此外还会影响细胞表面关键标志物的表达，如CD105下降。4. 影响增殖：蛋白因子的刺激一定程度上会影响MSC的增殖能力，促进细胞衰老。5. 安全性：基因编辑方式过程复杂，引入外源物较多，难于控制，临床应用安全性存在质疑。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法，通过添加L
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抗坏血酸衍生物与白细胞介素因子、肿瘤坏死因子联合顺次使用以持续、稳定的提高间充质干细胞抗炎功能，而不影响细胞增殖、免疫原性，以及后续临床应用的安全性。
[0004]为达到上述目的，本专利技术的技术方案实现方式如下：一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法，该方法包括如下步骤：（1）将细胞（复苏或传代的细胞（P1代至P10代））接种于培养容器中，并向培养基中添加L
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抗坏血酸衍生物进行培养；之后重复上述过程，连续传代2
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3次后恢复使用不含有L
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抗坏血酸衍生物的培养基继续培养；（2）之后向培养基中添加白细胞介素因子和/或肿瘤坏死因子继续培养，细胞达到80%
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90%融合时收获细胞。
[0005]进一步，所述L
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抗坏血酸衍生物为L
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抗坏血酸2
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葡糖苷、L
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抗坏血酸钠盐或L
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抗坏血酸钙盐中的一种或两种以上。
[0006]进一步，所述L
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抗坏血酸衍生物为L
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抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐。
[0007]进一步，添加的L
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抗坏血酸衍生物的终浓度为0.01
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0.1mM。
[0008]进一步，所述白细胞介素因子为IL
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1α、IL
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1β、IL
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6中的一种或两种以上，所述肿瘤坏死因子为TNF
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β和/或TNF
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α。
[0009]进一步，白细胞介素因子和肿瘤坏死因子组合使用，白细胞介素因子为IL
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1β，肿瘤坏死因子为TNF
‑
α。
[0010]进一步，白细胞介素因子的添加浓度为1
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5ng/ml，肿瘤坏死因子的添加浓度为1
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5ng/ml。
[0011]进一步，步骤（1）的培养条件为：37℃，5% CO2培养箱中培养66
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78小时，优选地，培养72小时；步骤（2）在传代后培养42
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54小时，优选地，培养48小时；之后再添加白细胞介素因子和/或肿瘤坏死因子继续培养18
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30小时，优选地，可培养24小时。
[0012]进一步，步骤（1）的初始接种密度为4000
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8000/cm2，后续每一次传代的接种密度为5000
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7000/cm2。
[0013]进一步，在步骤（1）中，在每一次细胞传代之前都需要用消化酶将消化成单细胞，并制成细胞悬液。
[0014]本专利技术还提供了一种由上述所述的方法构建的间充质干细胞。
[0015]本专利技术还提供了一种如上述任一项所述的方法在构建间充质干细胞上的应用。
[0016]相对于现有技术，本专利技术所述的增强间充质干细胞免疫调节能力的方法，克服了现有技术存在的诸多缺点，具有以下优越性：（1）更加持续稳定增强MSC抗炎免疫调节能力，较单独添加蛋白因子抗炎功能更强，持续性更好，批间处理更稳定；（2）增强抗炎及免疫活性的同时并未影响MSC细胞表面关键标志物改变，保证细胞质量的同时大大降低了临床应用过程风险；（3）与单纯使用蛋白因子预处理增强免疫活性相比，本专利技术采用的方法增强抗炎同时并未降低MSC增殖能力及对衰老的促进，进而保证了细胞的活性及制备产量；（4）本专利技术使用的是L
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抗坏血酸衍生物，其本身无毒，处理过程简单，且处理后易于从细胞上洗脱，对后续临床应用无安全性风险，且处理后的细胞降低促进血管生成能力，从而降低了MSC体内促瘤风险。
[0017]（5）与现有技术手段相比，本专利技术操作过程简单，降低了蛋白因子使用成本。
附图说明
[0018]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为上清中炎性因子TNFα的分泌情况；PBMC为阴性组，PBMC+LPS为阳性组，CT为对照组，即对比例1；A+I+T为L
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抗坏血酸衍生物与白细胞介素因子和肿瘤坏死因子联合使用组，1
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A+I+T为实施例1，2
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A+I+T为实施例2，3
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A+I+T为实施例3；A为只添加L
‑
抗坏血酸衍生物组，即对比例2；I+T为只添加白细胞介素因子和肿瘤坏死因子组，即对比例3；图2为上清中抗炎因子IL
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10的分泌情况；PBMC为阴性组，PBMC+LPS为阳性组，CT为对照组，即对比例1；A+I+T为L
‑
抗坏血酸衍生物与白细胞介素因子和肿瘤坏死因子联合使用组，1
‑
A+I+T为实施例1，2
‑
A+I+T为实施例2，3
‑
A+I+T为实施例3；A为只添加L
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抗坏血酸衍生物组，即对比例2；I+T为只添加白细胞介素因子和肿瘤坏死因子组，即对比例3；图3为CD105表型检测结果；（a）为实施例1，（b）为实施例2，（c）为实施例3，（d）为对比例1，（e）为对比例3；图4为细胞形态及融合度情况图；（a）为实施例1，（b）为实施例2，（c）为实施例3，（d）为对比例1，（e）为对比例3；
图5为培养后细胞数量图；CT为对照组，即对比例1；A+I+T为L
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抗坏血酸衍生物与白细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）将细胞接种于培养容器中，并向培养基中添加L
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抗坏血酸衍生物进行培养；之后重复上述过程，连续传代2
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3次后恢复使用不含有L
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抗坏血酸衍生物的培养基继续培养；（2）之后向培养基中添加白细胞介素因子和/或肿瘤坏死因子继续培养，细胞达到80%
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90%融合时收获细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述L
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抗坏血酸衍生物为L
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抗坏血酸2
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葡糖苷、L
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抗坏血酸钠盐或L
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抗坏血酸钙盐中的一种或两种以上。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述L
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抗坏血酸衍生物为L
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抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：添加的L
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抗坏血酸衍生物的终浓度为0.01
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0.1mM。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述白细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，曹宁，徐萌，郑阳阳，王艳红，吴康，姜岩，刘可可，乔倩，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：