一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其中使用的制备诱导性多能干细胞的microRNA组合物，包括miR

【技术实现步骤摘要】
一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法。

技术介绍

[0002]诱导性多能干细胞（iPSCs）技术是通过向终末分化细胞导入特定的转录因子，通过特定基因的表达将体细胞逆转为多能干细胞，使其具备类似于胚胎干细胞的全能性及无限增殖特性。
[0003]iPSCs技术开发早期多采用整合病毒载体介导来实现上述细胞逆转过程。最初使用“逆转录酶病毒”为载体向体细胞中植入几种转录因子基因，通过这些转录因子表达对细胞实现基因重编程，最终获得iPS细胞。而这种方法的缺陷是增加了宿主细胞基因组不稳定性风险，有可能会由于外源基因插入细胞基因组，而干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。慢病毒载体(LV)比逆转录病毒载体更有效，它具有广泛的亲和性，重编程效率高达0.1
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1%，但同样，此策略的安全性有待提高。
[0004]随着iPS技术不断发展，以及人们对其衍生的细胞产品用于药物开发及临床应用的迫切期望，科学家们正在积极的通过不同策略开发安全性更高的iPSCs诱导技术，以达到有效治疗应用的安全性和产品质量标准要求。目前已开发出的安全性更高的iPS技术策略分为通过病毒、非病毒方法介导的非整合转移系统重编程。
[0005]目前，腺病毒等非整合病毒载体介导的重编程技术已成功开发，大量数据证明此方法未造成宿主基因组中外源DNA插入。然而，目前非整合病毒载体传递方法的重编程效率仅限于0.001%。另一种替代方法是使用负性单链RNA仙台病毒(Se
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V)，因为它在许多类型的细胞和组织中导入外源基因非常有效。然而，这种方法受到了低重编程效率的阻碍。
[0006]非病毒方法主要包括：质粒法、化学小分子法、miRNA法等。质粒法是目前临床研究中使用较普遍的方法，利用质粒替代了传统的病毒载体，将转录因子基因导入细胞内部，但仍存在整合及外源基因残留风险，且重编程效率低等问题。为降低外源基因残留风险，通常需多次传代筛选来去除质粒残留，耗时耗力，同时增加了筛选成本。化学小分子法和miRNA法不涉及基因编辑等过程，无基因整合风险，是未来临床应用最有希望的技术策略，但二者诱导效率不理想，较慢病毒载体(LV)诱导率低5
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10倍。其中，化学小分子法突出优势为添加过程简单，但单独使用诱导效率较低，目前已报道的成功案例不多，通常与其他方法联用以提高诱导效率。microRNA法也属于小分子法，目前通常以脂质体包裹后电转方式递送至细胞内，科学家们已通过研究证明此策略的可行性。其中有文献报道miR
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291
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3p、miR
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294和miR
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295被用来代替c
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Myc来产生同质的人类iPSC。此外，有研究表明miRNA 302/367在不使用转录因子的情况下成功将小鼠和人类体细胞重编程为iPSCs。目前已有报道的调控体细胞重编程的miRNA家族主要包括miR
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302/367家族、miR
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200家族、miR
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290/295家族、miR
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34家族，此方法现有报道诱导效率为0.4
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0.7%，但后续报道研究及应用报道较少，推测其原因micRNA调控下游基因通常为一对多的复杂性，导致结果的不确定性和不稳定性。基于
microRNA法的低风险性以及已报到的大量技术可行性数据，其被公认为是针对未来临床应用产品最具前景的iPS诱导技术，但目前提升此方法的诱导效率仍为攻坚难点。
[0007]综上所述，现有主流游离型质粒或病毒介导iPS诱导技术存在的主要问题：（1）诱导过程繁琐，需要构建基因序列、制备病毒或质粒载体，同时增加了外源物质引入风险、全过程质控难点及成本，不利于技术未来产业化。（2）诱导技术的实现过程是间接，即先将基因导入细胞内，此过程无法控制每个细胞转染效率及程度的均一性，致使不同细胞中外源基因表达存在差异，进而影响这些转录因子与细胞基因组作用效果，最终导致得到的iPS细胞株个体差异较大，增加了筛选成本及时间，看似诱导效率较高，但实际最终得到的优质目的细胞株较少。（3）诱导技术最致命的缺点还是对细胞有致畸可能性，致使未来临床使用存在风险隐患。此外，化学小分子介导的iPS诱导技术现有的添加物组合诱导效率极低。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法。
[0009]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术的第一方面，提供了一种制备诱导性多能干细胞的microRNA组合物，包括miR
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5p、miR
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5p、miR
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520c
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3p、miR
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30e
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5p、miR
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519d
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3p、miR
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5p中的至少一种。
[0010]在本专利技术的一些实施例中，所述microRNA组合物中至少含有miR
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5p、miR
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211
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5p、miR
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520c
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3p、miR
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30e
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5p、miR
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519d
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3p、miR
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5p中的三种。
[0011]一种基于上述microRNA组合物制备诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：S1：培养贴壁细胞；S2：将microRNA组合物转染至培养后的贴壁细胞；S3：将持续转染后发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤S2中培养体系中microRNA组合物的终浓度不超过200nM。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤S2中培养体系中每种microRNA的物质的量均等。
[0014]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤S2中的microRNA组合物装载至脂质体或外泌体后进行转染。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤S2中的转染次数至少4次。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤S3中转染后的细胞传代三次以上得到诱导性多能干细胞。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤S3中转染后的细胞培养2
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3天，细胞融合度达到60
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70%进行重复传代。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，所述贴壁细胞为间充质干细胞、血管内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备诱导性多能干细胞的microRNA组合物，其特征在于：包括miR
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5p、miR
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5p、miR
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520c
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3p、miR
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30e
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5p、miR
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519d
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3p、miR
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5p中的至少一种。2.根据权利要求1所述的microRNA组合物，其特征在于：所述microRNA组合物中至少含有miR
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195
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5p、miR
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211
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5p、miR
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520c
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3p、miR
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30e
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5p、miR
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519d
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3p、miR
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32
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5p中的三种。3.一种基于权利要求1
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2任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐萌，曹宁，冀美超，张钰浩，张楠，刘可可，魏国清，陈英杰，田应洲，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：