一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及外泌体制备技术领域，公开了一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用。该内外工程化外泌体为CRV

【技术实现步骤摘要】
一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及外泌体制备
，具体涉及一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]近年来，肿瘤免疫微环境中的肿瘤相关巨噬细胞逐渐成为癌症治疗的新靶标。肿瘤免疫微环境是指肿瘤细胞的周围微环境，包括免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性抑制细胞、及细胞外成分，其中肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAM)约占50％，与肿瘤进展密切相关。小鼠模型研究发现TAM由卵黄囊和脾脏的巨噬细胞在趋化因子作用下募集到肿瘤部位形成的。且在不同因子的刺激下可极化成即M1(经典活化的巨噬细胞)和M2型(交替活化的巨噬细胞)。干扰素γ、脂多糖、TNFα等可诱导M1型巨噬细胞高表达iNOS、CD80等，产生多种一氧化氮、活性氧等杀伤分子，调节并促进Th1型细胞免疫应答，有效清除肿瘤细胞。肿瘤微环境中的其他细胞分泌的CSF
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1、IL1β、IL4、IL10等促进巨噬细胞M2型极化。M2型TAM促进肿瘤生长、浸润、侵袭迁移、血管形成，抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤恶化。在肿瘤早期M1型TAM比较多，随着肿瘤的进程逐渐以M2型为主。
[0003]目前成簇的规律间隔性短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)干扰是有效选择性抑制基因表达的方法，其主要通过CRISPR/dCas9系统实现。CRISPR/dCas9系统主要由single guide RNA(sgRNA)及dCas9两部分组成，dCas9在sgRNA的引导下特异性的结合到目的位点，与靶位点结合干扰转录酶的结合，在表观遗传方面抑制基因转录。但CRISPR/dCas9系统自身体系庞大、细胞内化效率低、且极易被生理环境中的各种酶降解而失效，无法直接进入细胞，需要有效的基因载体。而外泌体是直径为40
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160nm的具有脂质双层结构的细胞外囊泡，主要由蛋白质和脂质组成。与其他基因递送系统相比，外泌体有着以下优点。首先，外泌体是多功能载体，可以包裹并递送siRNA、mRNA和蛋白质等多种生物药物。其次，外泌体具有生物相容性，体内消除慢，在达到靶部位后可存留较长一段时间。另外外泌体有增强内吞作用的跨膜蛋白和脂锚定蛋白，更易被靶细胞摄取。再者，一个重要原因是外泌体的改造性强。然而，天然外泌体对于分子量较大的CRISPR
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dCas9系统负载效率低，远远达不到负载要求。因此需要对外泌体进行人工改造得到人工外泌体，将M2型肿瘤相关巨噬细胞高效重编程为M1型肿瘤相关巨噬细胞，从而激活其免疫治疗效应，以期为非小细胞肺癌的治疗提供帮助。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用。
[0005]本专利技术的第一方面提供一种内外工程化外泌体。
[0006]具体的，所述内外工程化外泌体为CRV
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293T外泌体负载NLS
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PBAE/dCas9
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KRAB
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sgPI3Kγ(NPC)；所述CRV
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293T外泌体通过修饰M2型肿瘤相关细胞(M2型TAM)靶向肽CRV到
HEK
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293T细胞中离心获得。
[0007]优选的，所述内外工程化外泌体的粒径为80
‑
150nm。
[0008]本专利技术的第二方面提供一种内外工程化外泌体的制备方法。
[0009]具体的，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)将Lamp2b
‑
CRV质粒和PX458
‑
AAVS1质粒混合转染HEK 293T细胞，制得CRV
‑
293T细胞；所述Lmp2b
‑
CRV质粒为Lamp2b克隆到载体中，使靶向肽CRV在Lamp2b之后表达；所述靶向肽CRV为CRVLRSGSC；
[0011](2)将所述CRV
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293T细胞进行离心，制得CRV
‑
293T外泌体；
[0012](3)将核定位信号与聚β氨基酯混合，制得核定位信号
‑
聚β氨基脂；
[0013](4)将所述核定位信号
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聚β氨基脂(NLS
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PBAE)与dCas9
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KRAB
‑
sgPI3Kγ质粒分别稀释后再混合、静置，制得NLS
‑
PBAE/dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ；所述dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ质粒由靶向小鼠PI3Kγ基因座的sgRNA插入载体生成；
[0014](5)将所述CRV
‑
293T外泌体重悬、冷冻、离心，制得CRV
‑
293T外泌体膜；
[0015](6)将所述NLS
‑
PBAE/dCas9
‑
KRAB
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sgPI3Kγ与所述CRV
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293T外泌体膜混合，制得内外工程化外泌体。
[0016]PX458
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AAVS1质粒购于Addgene plasmid：113194。
[0017]优选的，步骤(1)中，所述Lamp2b
‑
CRV质粒和PX458
‑
AAVS1质粒混合的比例为1
‑
10：1。
[0018]进一步优选的，步骤(1)中，所述Lamp2b
‑
CRV质粒和PX458
‑
AAVS1质粒混合的比例为1：1。
[0019]优选的，步骤(2)中，所述离心为1000
‑
5000g离心5
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25min后80000
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150000g离心30
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100min。
[0020]进一步优选的，步骤(2)中，所述离心为2500
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3500g离心10
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20min后95000
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105000g离心60
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80min。
[0021]优选的，步骤(4)中，所述NLS
‑
PBAE与dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ质粒分别稀释在pH为4
‑
8的缓冲溶液中。
[0022]进一步优选的，步骤(4)中，所述NLS
‑
PBAE与dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ质粒分别稀释在pH为5
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内外工程化外泌体，其特征在于，所述内外工程化外泌体为CRV
‑
293T外泌体负载NLS
‑
PBAE/dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ；所述CRV
‑
293T外泌体通过修饰M2型肿瘤相关细胞靶向肽CRV到HEK 293T细胞中离心获得。2.权利要求1所述内外工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将Lamp2b
‑
CRV质粒和PX458
‑
AAVS1质粒混合转染HEK 293T细胞，制得CRV
‑
293T细胞；所述Lmp2b
‑
CRV质粒为Lamp2b克隆到载体中，使靶向肽CRV在Lamp2b之后表达；所述靶向肽CRV为CRVLRSGSC；(2)将所述CRV
‑
293T细胞进行离心，制得CRV
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293T外泌体；(3)将核定位信号与聚β氨基酯混合，制得核定位信号
‑
聚β氨基脂；(4)将所述核定位信号
‑
聚β氨基脂与dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ质粒分别稀释后再混合、静置，制得NLS
‑
PBAE/dCas9
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KRAB
‑
sgPI3Kγ；所述dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI3Kγ质粒由靶向小鼠PI3Kγ基因座的sgRNA插入载体生成；(5)将所述CRV
‑
293T外泌体重悬、冷冻、离心，制得CRV
‑
293T外泌体膜；(6)将所述NLS
‑
PBAE/dCas9
‑
KRAB
‑
sgPI...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴宇，张灵敏，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：