敲低NKG2A基因的CAR-免疫细胞及其用途制造技术

本发明专利技术提出了一种CAR

【技术实现步骤摘要】
敲低NKG2A基因的CAR
‑
免疫细胞及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种敲低NKG2A基因的CAR
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免疫细胞及其用途，更具体地，本专利技术涉及一种CAR
‑
免疫细胞、药物组合物及其用途。

技术介绍

[0002]近年来，嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR
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T)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的效果。但是CAR
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T细胞在临床应用中易产生细胞因子风暴、神经毒性、GVHD等不良反应，而且CAR
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T细胞对实体瘤的治疗效果尚不理想，使得CAR
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T细胞的临床应用仍面临挑战。
[0003]CAR
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NK细胞较CAR
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T细胞具有安全性好的优势，一般不会引起细胞因子风暴和GVHD等副作用；NK细胞不需要抗原递呈、不受MHC限制，即可发挥直接的杀伤肿瘤细胞的作用；CAR
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NK细胞可以以CAR依赖和NKR依赖等多种识别机制识别和杀伤肿瘤，抗瘤谱广。因此，CAR
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NK细胞在抗肿瘤治疗中具有广泛的应用前景，已成为细胞免疫治疗研发领域的热点。但是，CAR
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NK细胞和CAR
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T细胞治疗实体瘤时均面临容易受肿瘤免疫抑制微环境影响的难题。
[0004]因此，继续开发一种不易受肿瘤免疫抑制微环境影响的CAR
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免疫细胞。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种敲低NKG2A基因的CAR
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免疫细胞，该CAR
‑
免疫细胞具有抵抗肿瘤免疫微环境的负调效应和抵抗细胞耗竭等优点。
[0006]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0007]目前，逆转肿瘤微环境导致免疫细胞耗竭的方法通常采用免疫检查点阻断疗法，即为通过使用免疫检查点抑制剂，例如免疫检查点分子的单克隆抗体，阻断T细胞或NK细胞表面抑制性受体与肿瘤微环境中肿瘤细胞或调节性T细胞、髓样细胞或基质细胞表面相应配体的结合，从而削弱对T细胞或NK细胞等免疫效应细胞功能抑制，唤醒其有效杀伤肿瘤的能力。但是，临床上，免疫检查点阻断疗法的应答率偏低，只有20％
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30％，且容易产生耐药。
[0008]NKG2A作为一个重要的免疫卡控点，主要表达在NK细胞表面，在NKT细胞和某些CD8+T细胞亚群亦有表达。NKG2A与CD94以异源二聚体的形式表达在细胞表面，主要识别非经典MHC
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I类分子HLA
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E，向NK细胞传递抑制性信号，抑制NK细胞的效应功能，即为肿瘤微环境高表达的NKG2A会削弱NK细胞等免疫细胞的活化和抗肿瘤功能。
[0009]基于此，专利技术人经过试验发现，相较于免疫检查点抑制剂，敲低NKG2A基因的CAR
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免疫细胞，不需要制备和开发单克隆抗体，敲低NKG2A的表达可直接阻断或取消其与配体HLA
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E的结合，从而阻断来自肿瘤微环境抑制性信号的诱导，防止进入肿瘤微环境的CAR
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免疫细胞受到抑制性微环境的抑制，从而有效抵抗耗竭，使CAR
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免疫细胞充分发挥抗肿瘤作用。
[0010]因此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种CAR
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免疫细胞。根据本专利技术的实施例，所述CAR
‑
免疫细胞的NKG2A基因被沉默；其中，所述CAR
‑
免疫细胞的免疫细胞包括NK细胞、T细胞、NKT细胞和γδT细胞中的至少之一。根据本专利技术实施例的CAR
‑
免疫细胞(尤其是CAR
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NK细胞)可阻断或取消NKG2A与配体HLA
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E的结合，防止进入肿瘤微环境的CAR
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免疫细胞受到抑制性微环境的抑制，且该CAR
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免疫细胞具有更强的肿瘤杀伤活性和IFN
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γ分泌能力，可有效抑制肿瘤细胞生长和延长小鼠的生存期，可用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述CAR
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免疫细胞的免疫细胞为NK细胞。
[0012]需要说明的是，在本专利技术中，CAR
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NK细胞的NK细胞的来源不受具体限制，包括但不限于NK
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92细胞、外周血NK细胞、脐带血NK细胞、iPSC来源NK细胞、NK
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92等不同来源的NK细胞，也适用于CAR
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NK细胞、CAR
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T细胞、CAR
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NKT细胞和CAR
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γδT细胞。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述NKG2A基因被沉默是通过敲除所述CAR
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免疫细胞的NKG2A基因实现的。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述敲除是通过CRISPR/Cas9系统实现的。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA具有如SEQ ID NO：8～10所示的核苷酸序列中的至少之一。由此，采用上述sgRNA可靶向敲低CAR
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免疫细胞(尤其是CAR
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NK细胞)中的NKG2A基因，获得沉默NKG2A基因的CAR
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免疫细胞，且该sgRNA的应用还可进一步降低CAR
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免疫细胞PD
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1和Tim
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3等其他抑制性受体的表达，从而提高CAR
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免疫细胞的肿瘤杀伤活性和IFN
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γ分泌能力，有效抑制肿瘤细胞生长和延长小鼠的生存期。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述敲除是通过如下方式进行的：将携带有所述sgRNA和编码Cas9分子的核酸的表达载体导入待改造的CAR
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免疫细胞进行培养处理。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述培养处理的时间为24～72h。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述表达载体为真核细胞表达载体。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述CAR
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免疫细胞的CAR包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体的C端与所述铰链区的N端相连，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原MSLN；跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的铰链区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述抗原包括选自间皮素(MSLN)、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CAR
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免疫细胞，其特征在于，所述CAR
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免疫细胞的NKG2A基因被沉默；其中，所述CAR
‑
免疫细胞的免疫细胞包括NK细胞、T细胞、NKT细胞和γδT细胞中的至少之一。2.根据权利要求1所述的CAR
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免疫细胞，其特征在于，所述CAR
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免疫细胞的免疫细胞为NK细胞；任选地，所述NKG2A基因被沉默是通过敲除所述CAR
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免疫细胞的NKG2A基因实现的。3.根据权利要求2所述的CAR
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免疫细胞，其特征在于，所述敲除是通过CRISPR/Cas9系统实现的；任选地，所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA具有如SEQ ID NO：8～10所示的核苷酸序列中的至少之一；任选地，所述敲除是通过如下方式进行的：将携带有所述sgRNA和编码Cas9分子的核酸的表达载体导入待改造的CAR
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免疫细胞进行培养处理；任选地，所述培养处理的时间为24～72h；任选地，所述表达载体为真核细胞表达载体。4.根据权利要求1～3任一项所述的CAR
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免疫细胞，其特征在于，所述CAR
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免疫细胞的CAR包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和铰链区，所述单链抗体的C端与所述铰链区的N端相连，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原；跨膜区，所述跨膜区的N端与所述胞外区的铰链区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连；任选地，所述抗原包括选自MSLN、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彩，胡渊，陈敏华，王烃，伏永玲，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：