一种神经胶质类工程细胞及其构建方法、应用技术

本发明专利技术属于工程细胞的构建和培养领域，具体涉及一种心肌细胞线粒体移植雪旺细胞的神经胶质类工程细胞及其构建方法、应用。所述工程细胞是由心肌细胞线粒体移植雪旺细胞中构建而成。本发明专利技术所培养的雪旺细胞工程细胞，具有较快的生长速度，能在较短的时间内达到实验或治疗所需的细胞数量。本发明专利技术所述的工程细胞构建方法，较为简单，原材料成本较低。本发明专利技术所构建的工程细胞，具有与原细胞系相同的细胞性质，能够较好地满足实验及其他要求。本发明专利技术所构建的工程细胞，与原细胞系相比较，能够较长期的稳定分泌更多的神经营养因子，具有广阔的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种神经胶质类工程细胞及其构建方法、应用


[0001]本专利技术属于工程细胞的构建和培养领域，具体涉及一种心肌细胞线粒体移植雪旺细胞的神经胶质类工程细胞及其构建方法、应用。

技术介绍

[0002]线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为细胞的“能量工厂”。其直径在0.5到1.0微米左右。线粒体普遍存在于哺乳动物的各类细胞内，来源广泛，在细胞内发挥着无可替代的作用。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
[0003]心肌细胞，又称心肌纤维，生物体内最为活跃的细胞之一。心肌细胞根据所具有的的功能不同，可以分为两大类，一类是工作细胞，主要存在于心房以及心室，富含肌原纤维，执行心脏的收缩功能；另一类被称为自律细胞，是一种特殊分化了的心肌细胞，具有兴奋性、传导性、自主产生节律性等特点，故称为自律细胞。心肌细胞为适应心肌持续性节律收缩活动，其胞内含有大量的糖原颗粒以及线粒体，以满足能量供应。
[0004]随着当今社会交通、建筑行业、制造业的快速发展，脊髓损伤以及其他类型的神经损伤发生率逐年上升，且神经损伤所带来的后遗症困扰患者余生，给个人的生活和家庭带来了沉重的负担，这使得神经修复的相关难题越发突出。行之有效的神经损伤修复方法少之又少，近几年，针对于脊髓损伤的治疗，已有了初步进展。在大鼠实验中，通过向损伤部位移植雪旺细胞，可以有效的促进损伤处脊髓的修复，但普通的雪旺细胞移植，效果还不尽人意，虽有促进损伤修复的作用，但其效果还未能达到理想状态。如何能够使得所移植的雪旺细胞在短时间内大量的传代，分泌更多的用来修复损伤神经的神经营养因子变得尤为重要。所以，能够在更短的时间内，获得移植所需要的雪旺细胞数量至关重要，过程每缩短一秒钟，就意味着神经损伤患者可以少承受一秒病痛的折磨。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题与不足，本专利技术提供一种神经胶质类的工程细胞，该细胞通过心肌细胞线粒体移植雪旺细胞构建而成，具有更快的生长速度，能够在更短的时间内生长到实验或治疗所需的细胞数量，并可以长期稳定的大量分泌神经营养因子。
[0006]本专利技术还提供了一种神经胶质类的工程细胞的构建方法。
[0007]本专利技术还提供了一种上述工程细胞在制备修复神经损伤药物中的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术涉及的具体技术方案如下：本专利技术提供了一种神经胶质类的工程细胞，所述工程细胞是由心肌细胞线粒体移植雪旺细胞中构建而成。
[0009]本专利技术还提供了一种神经胶质类的工程细胞的构建方法，包括以下步骤：（1）将200mg心肌组织，放入4℃预冷的PBS溶液中，剪碎，将碎块洗净，滤纸吸干，研
磨匀浆后制备高纯度线粒体；（2）用100
‑
200μl DMEM细胞培养液重悬线粒体，立即使用；（3）将提取出的纯化的心肌细胞线粒体加入到培养的贴壁雪旺细胞中，进行孵育培养，心肌细胞线粒体进入雪旺细胞。
[0010]进一步的，步骤（1）中，所述高纯度线粒体具体的制备过程为：（1）将洗净后的碎块放入小型玻璃匀浆器中；（2）向玻璃匀浆器中加入1mL预冷的Lysis Buffer，0℃冰上研磨匀浆，得匀浆物；（3）将研磨后的匀浆物转移至1.5mL离心管中，4℃，1000g
×
5min离心，收集上清液；（4）上清液转移至新的离心管中，4℃，1000g
×
5min再次离心，收集上清液；（5）将离心所得上清液，转移至新的1.5ml EP管中，4℃，12000g
×
10min离心，弃上清液，保留沉淀，沉淀为心肌细胞线粒体粗提物；（6）向线粒体粗提物中加入0.5
‑
1.0mL Wash Buffer，重悬，4℃，1000g
×
5min离心，取上清；（7）取上清液移入新的离心管中，4℃，12000g
×
10min离心，弃去上清，即得到高纯度的线粒体。
[0011]进一步的，步骤（3）中，所述贴壁雪旺细胞于6孔板中进行培养，接种量为：1.5
×
105/mL,于6孔板每孔加入3mL,5% CO2，37℃培养箱内培养12
‑
24小时，待细胞贴壁。
[0012]进一步的，步骤（3）中，所述心肌细胞线粒体加入至雪旺细胞的量为：将200mg心肌组织所提取的纯化线粒体，用120μl DMEM细胞培养基重悬，于6孔板中每孔加入20μl。
[0013]进一步的，步骤（3）中，所述孵育培养的条件为：5% CO2，37℃培养箱，共孵育12小时。
[0014]本专利技术还提供了一种上述神经胶质类的工程细胞在制备修复神经损伤的药物中的应用。
[0015]本专利技术所使用的的心肌组织的获取步骤为：1）将4周龄Wistar大鼠，按照3mL/kg腹腔注射10%水合氯醛，3
‑
5min后大鼠麻醉；2）将麻醉后的大鼠，沿腹中线用手术剪剪开，暴露心脏，用眼科剪剪取约200mg心肌组织，于4℃预冷的PBS溶液中剪成3
‑
5mm的碎块。
[0016]本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术所培养的雪旺细胞工程细胞，具有较快的生长速度，能在较短的时间内达到实验或治疗所需的细胞数量。
[0017]（2）本专利技术所述的工程细胞构建方法，较为简单，原材料成本较低。
[0018]（3）本专利技术所构建的工程细胞，具有与原细胞系相同的细胞性质，能够较好地满足实验及其他要求。
[0019]（4）本专利技术所构建的工程细胞，与原细胞系相比较，能够较长期的稳定分泌更多的神经营养因子。
[0020]（5）通过本专利技术构建的工程细胞，用于修复脊髓损伤时，能够较好的抑制损伤部位炎症因子的表达，促进抑炎因子的表达；修复方法简单，原材料成本较低；且无任何毒副作用，对机体二次损伤较小。
附图说明
[0021]图1为本专利技术制备的工程细胞工程细胞的双光子激光共聚焦显微镜图像。
[0022]图2为本专利技术制备的工程细胞的细胞活力图。
[0023]图3为本专利技术制备的工程细胞分泌的各类神经营养因子含量图。
[0024]图4为本专利技术制备的工程细胞各类神经营养因子分泌量。
[0025]图5为工程细胞应用后抑炎因子IL
‑
10和促炎因子IL
‑
1β表达程度图。
[0026]图6为抑炎因子IL
‑
10和促炎因子IL
‑
1β量化分析对比图。
[0027]图7为本专利技术制备的工程细胞修复后损伤处脊髓结构图。
具体实施方式
[0028]以下通过具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术的范围仅限于以下的实例。在不脱离本专利技术上述方法思想的情况下，根据本领域普本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经胶质类的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是由心肌细胞线粒体移植雪旺细胞中构建而成。2.一种如权利要求1所述的神经胶质类的工程细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将200mg心肌组织，放入4℃预冷的PBS溶液中，剪碎，将碎块洗净，滤纸吸干，研磨匀浆后制备高纯度线粒体；（2）用100
‑
200μl DMEM细胞培养液重悬线粒体，立即使用；（3）将提取出的纯化的心肌细胞线粒体加入到培养的贴壁雪旺细胞中，进行孵育培养，心肌细胞线粒体进入雪旺细胞。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高纯度线粒体具体的制备过程为：（1）将洗净后的碎块放入小型玻璃匀浆器中；（2）向玻璃匀浆器中加入1mL预冷的Lysis Buffer，0℃冰上研磨匀浆，得匀浆物；（3）将研磨后的匀浆物转移至1.5mL离心管中，4℃，1000g
×
5min离心，收集上清液；（4）上清液转移至新的离心管中，4℃，1000g
×
5min再次离心，收集上清液；（5）将离心所得上清液，转移至新的1.5ml EP管中，4℃，12000g
×
10min离心，弃上清液，保...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨革，刘璐，车程川，刘金锋，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：