一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用技术

本发明专利技术提供了一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用，属于生物医用材料与细胞分子治疗技术领域。本发明专利技术通过多轮筛选得到一段与丝素蛋白具有较强亲和性的丝素亲和肽，将丝素亲和肽在外泌体膜蛋白中融合表达有利于增强外泌体与亲和蛋白的结合性能，同时外泌体的膜蛋白通过融合表达MS2结构域，可高效捕捉大量特异性miRNA，从而发挥特定的功能作用。丝素蛋白结合丝素亲和性工程化外泌体后，提高了外泌体的稳定性及其在受体细胞中的内化效应，为生物分子活性材料在组织修复与再生医学领域的应用提供了研究基础，同时为临床中组织损伤修复的高效精准治疗提供了理论和技术支撑。技术支撑。技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用


[0001]本专利技术属于生物医用材料与细胞分子治疗
，具体涉及一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用。

技术介绍

[0002]随着细胞分子治疗技术的快速发展，外泌体治疗成为生物医疗领域研究的热点，并受到广泛的关注。外泌体是细胞外分泌囊泡中的一员，它可以作为运输载体，装载细胞内特定的蛋白和RNA等成分，通过融合到靶细胞膜或者靶细胞胞吞作用摄入，将活性因子直接递送到靶细胞内部，对受体细胞组织发挥有效调控作用。相比于干细胞治疗，干细胞来源的外泌体，不仅含有干细胞分泌的多种有效成分，而且可以避免异种来源细胞表面抗原带来的一过性排异反应，在临床治疗应用上更加安全。目前，以工程化修饰的外泌体为载体装载特定基因和活性药物等有效成分从而获得具备特异调控作用的功能性外泌体，成为外泌体治疗的应用热点与发展方向。然而，功能性外泌体需要有效的缓释保存模式来发挥持续性调控作用。
[0003]在临床治疗过程中，给药方式与治疗效果直接相关，如果药物无法有效地持续作用机体，那么治疗效果往往大打折扣。外泌体的半衰期很短，活性保持困难，而生物材料作为活性分子载体，可为外泌体治疗模式开启无限可能。功能性外泌体与生物材料相结合用于靶向调控分子的持续输送，有望为各类创伤修复的精准治疗带来新的希望。外泌体结合生物活性材料已经开始应用于皮肤、心血管以及骨与软骨等组织的损伤修复治疗。在组织修复与再生生物材料中，丝素蛋白作为天然的蛋白成分具有抗菌性，可防止病原体的侵袭和增殖，从而降低感染的风险，加之良好的生物相容性、可降解性及优良的机械性能，使其成为组织修复与再生应用中新的生物材料研究方向。值得注意的是，丝素蛋白材料对外泌体的加载能力可能与外泌体在生物材料上的结合效率密切相关。如何增强外泌体与丝素蛋白的高效结合与持续释放是构建丝素亲和性工程化外泌体的关键技术问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法，使构建的丝素亲和性工程化外泌体在丝素蛋白中具有高效结合和持续释放特性。
[0005]本专利技术的目的还在于提供一种结合丝素蛋白的功能性外泌体，具有持续内化作用，具有良好的保存稳定性和体内稳定性，从而能有效提高外泌体活性成分的疗效。
[0006]本专利技术提供了一种丝素亲和性工程化外泌体，所述外泌体的膜蛋白为融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白Lactadherin；
[0007]所述丝素蛋白结合肽插入膜蛋白Lactadherin中SP和C1C2结构域之间；
[0008]所述丝素蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]优选的，所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]优选的，所述外泌体装载miR146a；所述外泌体的膜蛋白还为融合表达MS2结构域；
[0011]所述MS2结构域在膜蛋白Lactadherin中C1C2结构域的C端表达；
[0012]所述MS2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013]本专利技术提供了一种所述丝素亲和性工程化外泌体的构建方法，包括以下步骤：
[0014]1)构建含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒；
[0015]2)将步骤1)中所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒；
[0016]3)将步骤2)中所述包装的慢病毒颗粒感染细胞，经筛选，得到的阳性细胞进行培养，收集上清液，分离丝素亲和性工程化外泌体。
[0017]优选的，步骤1)中所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018]优选的，步骤2)中所述转染的方法为将制剂1和制剂2混合，加至无血清培养基孵育的细胞中，4～6h后更换为有血清培养基，继续培养48～72h；
[0019]所述制剂1为含Lipo2000的Opti
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MEM培养基；所述Opti
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MEM和Lipo2000的体积比为250:10；
[0020]所述制剂2为含miR146a质粒和MS2质粒的Opti
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MEM培养基；所述Opti
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MEM、miR146a质粒和MS2质粒的质量比为250:2:2。
[0021]优选的，融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0022]当外泌体装载miR146a时，所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒和含miR146a前体序列的慢病毒质粒共同转染细胞。
[0023]本专利技术提供了一种结合丝素蛋白的功能性外泌体，为所述丝素亲和性工程化外泌体或所述构建方法得到的丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白结合形成的复合体；
[0024]所述丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白的质量比约为1:10。
[0025]本专利技术提供了所述丝素亲和性工程化外泌体或所述结合丝素蛋白的功能性外泌体在组织修复与再生中的应用。
[0026]优选的，所述组织修复与再生包括以下一种或几种组织损伤修复：皮肤组织损伤修复与再生、心血管组织修复与再生、骨组织修复与再生和软骨组织修复与再生。
[0027]本专利技术提供了一种丝素亲和性工程化外泌体(SGM
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Exo)，本专利技术通过多次筛选得到一段与丝素蛋白具有较强亲和性的丝素亲和肽，根据丝素亲和肽设计得到丝素蛋白结合肽，将丝素蛋白结合肽在外泌体膜蛋白中融合表达，从而增强外泌体与丝素蛋白的结合效率和持续释放，为制备以外泌体作为活性分子载体的功能性药物提供了研究基础。
[0028]进一步，本专利技术外泌体的膜蛋白的C端还融合表达MS2结构域，MS2结构域可通过miR146a两端的pac位点高效捕捉大量miR146a，miR146a作为药物活性成分，发挥抑制炎症反应的作用。
[0029]本专利技术提供了一种结合丝素蛋白的功能性外泌体(SGM
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Exo@SFP)，为所述丝素亲和性工程化外泌体或所述构建方法得到的丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白结合形成的复合体。本专利技术实验将结合功能性外泌体的丝素蛋白贴片浸提液作用于HaCat细胞，结果表明功能性外泌体可以持续内化作用于受体细胞。同时从体外保存、体内应用以及miRNA三
方面评估了SGM
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Exo@SFP的稳定性，结果表明无论在室温还是低温保存，SGM
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Exo@SFP的存储稳定性都得到显现提升；体内应用实验表明，丝素亲和性工程化外泌体结合丝素蛋白后的持续释放和活力稳定性得到提升；同时丝素亲和性工程化外泌体中所含的基础miR146a表达量更加稳定，从而提高了功能性外泌体的应用效果。
附图说明
[0030]图1为丝素蛋白亲和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丝素亲和性工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体的膜蛋白为融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白Lactadherin；所述丝素蛋白结合肽插入膜蛋白Lactadherin中SP和C1C2结构域之间；所述丝素蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述丝素亲和性工程化外泌体，其特征在于，所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求1所述丝素亲和性工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体装载miR146a；所述外泌体的膜蛋白还为融合表达MS2结构域；所述MS2结构域在膜蛋白Lactadherin中C1C2结构域的C端表达；所述MS2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.一种权利要求1～3任意一项所述丝素亲和性工程化外泌体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒；2)将步骤1)中所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒；3)将步骤2)中所述包装的慢病毒颗粒感染细胞，经筛选，得到的阳性细胞进行培养，收集上清液，分离丝素亲和性工程化外泌体。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤2)中所述转染的方法为将制剂1和制剂2混合，加至无血清培养基孵育的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩坤，胡文治，张翠萍，付小兵，杨润功，续琴，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第一医学中心，
类型：发明
国别省市：