一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法技术

本发明专利技术公开一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，在中性条件下携带弱负电或电中性脂质体，在弱酸性条件下进行mRNA装载，将mRNA与阳离子脂质体共孵育后装载细胞外囊泡，装载后的细胞外囊泡通过超滤换液恢复到中性；抽提样品中的RNA，通过RT

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法


[0001]本专利技术属于生物制品
，尤其是涉及一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular vesicles)是一种直径在30
‑
150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。尽管细胞外囊泡早在1983年就被发现，但当时人们普遍认为它是细胞代谢的废弃物，主要作用是在新陈代谢过程中承担扔废料的角色。然而2007年，研究人员发现细胞外囊泡含有母细胞来源的蛋白、脂质和核酸，并能作为信号分子传递其他细胞从而改变靶细胞功能。随着研究结果的不断发现，把细胞外囊泡研究与转化研究推向了新的时代。
[0003]除了对天然细胞外囊泡的功能性研究，改造并赋予细胞外囊泡新功能也是目前科研热点领域，即通过体内或体外方式装载功能性小分子、核酸或蛋白质，使细胞外囊泡成为良好的生物药递送载体。其中核酸是指寡核苷酸分子，包括小干扰核酸（siRNA）、反义核酸（ASO）、微小RNA（miRNA）、信使核糖核酸（mRNA）和核酸适体（Aptamer）。核酸药物由核苷酸组成，与小分子药物和抗体药物完全不同。主要的小核酸药物有siRNA药物和反义核酸（ASO）药物。它们主要作用于细胞质mRNA，通过碱基互补识别和抑制靶mRNA，调节蛋白表达，达到治疗疾病的目的。因为新冠疫情影响，针对新冠病毒的mRNA疫苗也成为目前科研热点领域，由美国辉瑞公司和Moderna公司生产的mRNA疫苗以脂质体为载体，而细胞外囊泡因为其低毒性和生物相容性被认为是未来可能替代脂质体的载体方案。
[0004]一般来说，通过体外装载生物分子的尺寸较小，例如siRNA药物和反义核酸（ASO）药物，但是一段典型mRNA（1000 bp）的线性长度约为300 nm，超过了典型细胞外囊泡的最大尺寸，所以细胞外囊泡装载大分子量mRNA一直是一个挑战。传统的解决方案是通过体内装载的方法，分为两条技术路线，其一是被动装载，即构建mRNA过量表达载体，将载体转染进细胞之后，过量表达目标mRNA，使其被动装载到细胞分泌的细胞外囊泡中；其二是主动装载，利用在细胞外囊泡中过量表达的RNA结合蛋白，结合mRNA并定位到细胞外囊泡中。
[0005]但是传统mRNA体内装载细胞外囊泡解决方案有一定局限性，体现在三个方面：（1）mRNA必须来源于细胞体内表达，而对于一些现代生物产业应用场景，例如制备mRNA疫苗的核酸，其中存在必要的人工化学修饰用于增强生物活性，降低毒性，提高体内稳定性，而生物体内无法生产人工化学修饰成分，例如使用假尿嘧啶核苷作为mRNA合成原料，为了降低降低细胞的天然免疫反应；（2）细胞外囊泡来源细胞必须容易进行基因编辑并且可以大规模培养，这就限制了细胞外囊泡来源，例如一些原代细胞难以进行基因编辑，诸如牛奶来源细胞外囊泡和尿液来源细胞外囊泡的工程化改造，都很难通过体内改造细胞获得；（3）体内装载mRNA需要设计并合成基因表达载体，在基因层面改造细胞，对实验操作技术水平要求
高，实验成本高且周期长，无法用于实验级别快速筛选判断目标mRNA在细胞外囊泡中的装载效率，因为制备工艺复杂也很难进行工业放大生产。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，将mRNA与阳离子脂质体共孵育后装载细胞外囊泡。
[0008]优选地，选取在中性条件下携带弱负电或电中性脂质体，在弱酸性条件下进行mRNA装载；装载后的细胞外囊泡通过超滤换液恢复到中性。
[0009]优选地，检测装载前后mRNA拷贝数，比值为mRNA在细胞外囊泡中的包封率。
[0010]优选地，抽提样品中的RNA，通过RT
‑
qPCR定量检测mRNA拷贝数。
[0011]优选地，将mRNA与脂质体混合，加入柠檬酸钠，孵育，加入细胞外囊泡后再孵育。
[0012]优选地，将阳离子脂质溶于三氯甲烷，氮气吹干之后，用PBS复溶，手动或电动挤出器挤出形成脂质体。
[0013]优选地，阳离子脂质体为Dlin
‑
MC3
‑
DMA（4
‑
(N,N
‑
二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯）、DOTAP（N
‑
(2,3
‑
Dioleoyloxy
‑1‑
丙基)三甲胺甲基硫酸甲酯）、DSPC（1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
丙三基
‑3‑
磷酸胆碱）、DC
‑
Chol（N', N'
‑
二甲基乙二胺基氨甲酞基胆固醇）、DOP
‑
DEDA（胆固醇和二油酰甘油磷酸二乙二胺结合物）、 DOTMA（1,2
‑
双十八烯氧基
‑3‑
甲基铵丙烷）、DODMA（1,2
‑
二油醇
‑3‑
二甲基氨基
‑
丙烷）中的一种或几种。
[0014]优选地，细胞外囊泡为牛奶来源细胞外囊泡、人源细胞来源细胞外囊泡或尿液来源细胞外囊泡。
[0015]细胞外囊泡体外装载mRNA的方法在制备生物制品中的应用。
[0016]本专利技术具有的优点和积极效果是：与传统装载方法比较，本专利技术提供的方法操作简单，对操作技术水平要求低、实验周期短、成本低；对于所要转载的mRNA限制少，相应的具有较广的应用范围；另外，在中性条件下携带弱负电或电中性脂质，在弱酸性条件下进行mRNA装载，装载后的细胞外囊泡通过换液的方法恢复到中性环境，可以规避阳离子脂质体携带正电荷而存在细胞毒性的问题；通过本方法装载mRNA，最大限度保留了细胞外囊泡的样本，通过RT
‑
qPCR技术即使低浓度或微量检测也能够获得较佳信号值，通过比较装载前后mRNA差值，可计算mRNA在细胞外囊泡中的包封率。
附图说明
[0017]图1是本专利技术细胞外囊泡体外装载mRNA的方法示意图；图2是对比例体内mRNA装载HEK293T人胚胎肾细胞来源细胞外囊泡检测结果；图3是实施例1中Dlin
‑
MC3
‑
DMA脂质体电镜形态图；图4是实施例1中阳离子脂质体Dlin
‑
MC3
‑
DMA在不同pH下的带电性质；图5是使用Dlin
‑
MC3
‑
DMA脂质体、DOTAP脂质体装载试剂（Roche
TM
）和
Lipofec本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：将mRNA与阳离子脂质体共孵育后装载细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：选取在中性条件下携带弱负电或电中性脂质体，在弱酸性条件下进行mRNA装载；装载后的细胞外囊泡通过超滤换液恢复到中性。3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：检测装载前后mRNA拷贝数，比值为mRNA在细胞外囊泡中的包封率。4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：抽提样品中的RNA，通过RT
‑
qPCR定量检测mRNA拷贝数。5.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：将mRNA与脂质体混合，加入柠檬酸钠，孵育，加入细胞外囊泡后再孵育。6.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：将阳离子脂质溶于三氯甲烷，氮气吹干之后，用PBS复溶，手动或电动挤出器挤出形成脂质体。7.根据权利要求1
‑
4中任一所述的细胞外囊泡体外装载mRNA的方法，其特征在于：阳离子脂质体为Dlin
‑
MC3
‑
DMA（4
‑
(N,N
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，柴天聪，陆路，张权，田应洲，王达，尹建新，王淼，韩春乐，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：