外泌体分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种外泌体分离纯化方法，取含有外泌体的体液或培养液，经过阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛层析后获得纯化后的外泌体溶液。通过这样的提纯方法即便在大规模的外泌体需求中，也能够低成本、高效率的获得高纯度的外泌体；与现有的外泌体纯化方法如离心法、PEG多聚物沉淀法、亲和层析法、超滤法、分子筛尺寸排阻色谱法相比，本发明专利技术可以实现不同体积（100ml至500L）外泌体纯化，尤其杂质蛋白较多的乳源制品，也可获得纯度99%以上的乳源外泌体，同时具有低成本及高回收率的优势，能满足工业化生产的需求。能满足工业化生产的需求。能满足工业化生产的需求。

【技术实现步骤摘要】
外泌体分离纯化方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种外泌体分离纯化方法。

技术介绍

[0002]外泌体是由活细胞分泌的直径约为30
‑
200 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构及茶托型结构，主要分泌于细胞培养上清液、乳汁、血清、血浆、唾液、尿液、羊水及植物组织中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种治疗药物的载体及一些疾病的早期诊断标志物。
[0003]牛奶外泌体是进化上保守的独特微泡类别，其在穿过胃和胃肠道途中保持其内含的核酸和蛋白质的完整性，它们可以在局部发挥作用或被运送到循环系统中。此外，牛奶外泌体比其他天然存在的外泌体更稳定，其在酸性条件下或其他恶劣条件下表现出比其他来源的外泌体更高的稳定性，同时作为外泌体它具有低免疫原性及高度的血脑屏障通透性。牛奶外泌体的这种特性可用来实现蛋白质、多肽、核酸、小分子化学物等药物的载体，并可通过口服给药增加药物的耐受性。
[0004]目前外泌体制备方法主要由以下几种方法：一是离心法，主要通过增加离心力逐级沉降或使用特定的介质根据外泌体自身密度使其悬浮于特定的位置，从而达到外泌体的分离、纯化的目的。离心法目前是提取分离外泌体最常用的方法，被认为是分离外泌体的“金标准”，其优点是操作简单，分离的外泌体纯度较高，但整个工艺处理时间长通常大于5h，同时样品量受离心机限制处理量较少，所分离的外泌体的种类、数量及质量受离心过程参数（离心力及离心时间）影响较大，样品质量属性的重现性较差。
[0005]二是PEG多聚物沉淀法，该方法主要通过多聚物与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀达到分离外泌体的目的，此方法操作简单，可实现大批量分离且能显著提高外泌体产量，但获得外泌体纯度较低，通常混有大量共沉淀的蛋白及核酸杂质。
[0006]三是亲和层析法，包括免疫亲和层析及磷脂酰丝氨酸亲和层析法，此方法是一种通过外泌体表面的膜蛋白（CD9、CD81、CD63、TIM4）与其相应的抗体或磷脂酰丝氨酸亲和吸附来达到外泌体的分离，此方法分离的外泌体特异性及纯度高，外泌体形态完整，但亲和层析介质昂贵，纯度成本较高，无法进行工业大规模分离纯化。尤其亲和层析过程需要先将外泌体吸附，再通过洗脱的方式将其分离获得，从操作上来看更为复杂。
[0007]四是超滤法，此方法通过不同截留分子量的超滤膜将外泌体与样本中杂质分子根据其大小进行分离纯化，具有操作过程简单、样品处理量大及较高的浓缩倍数的优点，但分离后的外泌体纯度较低。
[0008]五是尺寸排阻色谱法，该方法通过外泌体与杂质分子量大小的不同，在经过层析柱中不同孔径及粒径的凝胶填料时达到分离纯化的目的，具有操作简单、重现性好及纯度高等优点，但样品处理量较少，对层析设备有较高要求。
[0009]综上所述，目前外泌体的分离纯化方式存在无法同时满足高纯度、低成本、高回收
率及工业化生产等问题，尤其面对处理大量原料时，获得的外泌体纯度和产量更是需要付出极大代价。

技术实现思路

[0010]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种外泌体分离纯化方法。
[0011]本专利技术采用的技术方案是：外泌体分离纯化方法，取含有外泌体的体液或培养液，先3000g
‑
8000g离心，离心后取上清和/或过滤器除蛋白的方法去除沉淀蛋白，然后通过深层滤器进行深层过滤去除脂肪球，再经阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛层析，获得的流穿液为纯化后的外泌体溶液。
[0012]优选地，进行阴离子交换层析、阳离子交换层析和/或分子筛层析前预先进行超滤。
[0013]优选地，阴离子交换层析填料的配基为强阴离子交换配基或弱阴离子交换配基。
[0014]优选地，阴离子交换配基为季铵基、二乙氨基乙基、二乙氨基丙基中的一种或几种的组合，填料粒径范围为15
‑
300μm，孔径范围为20
‑
150nm，阴离子交换层析过程中平衡缓冲液pH为7.0
‑
7.4，缓冲液电导率不高于10ms/cm。
[0015]优选地，阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基。
[0016]优选地，阳离子交换配基为磺酸基丙基或羧甲基的一种或两种的组合，填料粒径范围为15
‑
300μm，孔径范围为20
‑
150nm，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液pH为8.0
‑
8.4，缓冲液电导率不高于10ms/cm。
[0017]优选地，含有外泌体的体液为乳源样品时，预先对样品进行杂质去除处理；杂质去除处理为酸沉淀、凝乳酶处理和盐析处理中的一种或多种的组合。
[0018]优选地，杂质去除处理为去除杂质蛋白和/或脂肪球，其中杂质蛋白为酪蛋白及其他等电点为pH4.0
‑
5.5的杂蛋白。
[0019]优选地，具体步骤如下：一级纯化：对乳源样品进行杂质去除处理，去除杂质后得到外泌体粗提液；二级纯化：实施方式一、方式二和方式三的纯化步骤，其中方式一、方式二和方式三能够按照任意顺序进行排布，方式一、方式二和方式三均至少包括一次；可按照方式一
‑
方式二
‑
方式三的顺序，或者按照方式二
‑
方式一
‑
方式三的顺序，或者按照方式三
‑
方式一
‑
方式二的顺序，或者按照方式一
‑
方式三
‑
方式二的顺序，或可根据实际情况对某一种方式重复进行，如按照方式一
‑
方式三
‑
方式二
‑
方式三的顺序，以及其他类似规律的排布方式均属于本专利技术所要求权利范围；方式一：将上一步骤纯化所得溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体粗提液进行阴离子交换层析进行纯化，取流穿液；方式二：将上一步骤纯化所得溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体溶液进行阳离子交换层析进行纯化，取流穿液；方式三：将上一步骤纯化所得溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；
对浓缩后的外泌体溶液进行分子筛层析进行纯化，取外水峰范围流穿液；最终获得的外泌体纯化溶液即为纯化后的外泌体溶液。
[0020]优选地，乳源样品为生乳样品、脱脂乳样品或巴氏消毒乳样品。
[0021]本专利技术具有的优点和积极效果是：在大规模的外泌体需求中，能够低成本、高效率的获得高纯度的外泌体；与现有的外泌体纯化方法如离心法、PEG多聚物沉淀法、亲和层析法、超滤法、分子筛尺寸排阻色谱法相比，本专利技术可以实现不同体积（100ml至500L）外泌体连续纯化，以流穿的模式代替传统色谱柱的洗脱模式，简化分离步骤，缩短纯化周期，不同色谱柱配合使用时，更显优势；尤其处理杂质蛋白较多的乳源制品，也可获得纯度99%的乳源外泌体，同时与具有低成本及高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外泌体分离纯化方法，其特征在于：取含有外泌体的体液或培养液，先3000g
‑
8000g离心，离心后取上清和/或过滤器除蛋白的方法去除沉淀蛋白；然后通过深层滤器进行深层过滤去除脂肪球；再经阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛层析，获得的流穿液为纯化后的外泌体溶液。2.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：进行阴离子交换层析、阳离子交换层析和/或分子筛层析前预先进行超滤。3.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述阴离子交换层析填料的配基为强阴离子交换配基或弱阴离子交换配基。4.根据权利要求3所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：阴离子交换配基为季铵基、二乙氨基乙基、二乙氨基丙基中的一种或几种的组合，填料粒径范围为15
‑
300μm，孔径范围为20
‑
150nm，阴离子交换层析过程中平衡缓冲液pH为7.0
‑
7.4，缓冲液电导率不高于10ms/cm。5.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液pH为8.0
‑
8.4，缓冲液电导率不高于10ms/cm。6.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：阳离子交换配基为磺酸基丙基或羧甲基的一种或两种的组合，填料粒径范围为15
‑
300μm，...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，王淼，陆路，田应洲，陈巍，杜焕青，韩春乐，王飞，温智钧，高梦雅，王帅，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：