一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法技术

本发明专利技术提供了一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法，发明专利技术所属研究领域为皮肤外植体模型技术领域。模型构建方法包括以下步骤：将奶牛趾间皮肤浸入运输培养基中运输，运输完成后使用洗涤培养基清洗奶牛趾间皮肤，将清洗后的奶牛趾间皮肤培养于含有组织培养基的细胞小室中，完成模型构建；最后对奶牛趾间皮肤外植体模型进行可行性评估。本发明专利技术所构建3D奶牛趾间皮肤模型符合减少、替代、优化等实验动物3R原则，同时所构建的模型能够维持良好的组织结构完整性，充分模拟奶牛趾间皮肤在体环境，对深入研究奶牛趾间皮肤病原微生物侵入作用机制具有重要意义。制具有重要意义。制具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法


[0001]本专利技术涉及皮肤外植体模型
，具体涉及一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法。

技术介绍

[0002]随着畜牧养殖行业的快速发展，奶牛肢蹄病已经成为继乳房炎和繁殖障碍之后危害奶牛健康养殖的第三大疾病，奶牛肢蹄病是对由环境、管理、营养以及生理等多种不良饲养因素引起奶牛肢蹄部位发生病变的总称。据联合国粮农组织统计，在发达国家奶牛肢蹄病发病率为15％；在发展中国家发病率高达30％～40％。肢蹄病可导致奶牛生产和繁殖性能降低、利用年限缩短以及治疗费用增加等，给奶牛产业带来巨大的经济损失。
[0003]奶牛趾间皮肤常见感染性疾病包括腐蹄病、蹄皮炎、趾间皮炎等。患病奶牛蹄部皮肤常表现出坏死和裂开，炎症自趾间向皮肤各处蔓延，并伴有全身性症候，奶牛趾间感染性蹄病已经成为一类影响奶牛肢蹄健康的重要群发性疾病。国内外对该类疾病的的炎症发病机理报道较少，究其原因，主要是对奶牛趾间皮肤研究受到实验动物3R(Replacement，Reduction，Refinement)原则以及伦理学等因素的限制。奶牛趾间皮肤外植体模型既能够满足奶牛趾间皮肤感染性疾病研究需要，又符合实验动物伦理要求，因此本专利技术能够促进奶牛趾间皮肤感染机制的离体试验深入研究，进而推动奶牛健康养殖的可持续性发展。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法，该方法构建的奶牛趾间皮肤外植体模型具有高稳定性、高重复性的特点，此外该模型的构建能够大大降低实验动物的使用频率。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法，包括以下步骤：
[0007]将奶牛趾间皮肤浸入运输培养基中运输，运输完成后使用洗涤培养基清洗奶牛趾间皮肤，将清洗后的奶牛趾间皮肤培养于含有组织培养基的细胞小室中，完成模型构建，最终对奶牛趾间皮肤外植体模型进行可行性评估；
[0008]所述运输培养基的成分包括DMEM/F
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12培养基、青霉素
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链霉素
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两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素、L
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谷氨酰胺；
[0009]所述洗涤培养基的成分包括DMEM/F
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12培养基、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素；
[0010]所述组织培养基的成分包括高糖DMEM培养基，DMEM/F
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12培养基、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素、L
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谷氨酰胺、胎牛血清。
[0011]优选地，所述运输培养基中，硫酸庆大霉素的浓度为4～6μg/mL，所述DMEM/F
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12培养基、青霉素
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链霉素
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两性霉素B溶液与L
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谷氨酰胺的体积比为(97.5～98.5)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)。
[0012]优选地，所述洗涤培养基中，硫酸庆大霉素的浓度为1～3μg/mL，所述DMEM/F
‑
12培养基与青霉素
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链霉素
‑
两性霉素B溶液的体积比为(98.5～99.0)：(0.9～1.1)。
[0013]优选地，所述组织培养基中，所述高糖DMEM培养基、DMEM/F
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12培养基、青霉素
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链霉素
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两性霉素B溶液、L
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谷氨酰胺与胎牛血清的体积比为(63～66)：(21～22)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)：(9～11)，所述硫酸庆大霉素的浓度为4～6μg/mL。
[0014]优选地，所述清洗的次数为2～4次，每次10～20min。
[0015]优选地，所述的细胞小室包括内室和外室，外室添加的组织培养基的含量为1～3mL。
[0016]优选地，所述的细胞小室包括内室和外室，内室中添加组织培养基至奶牛趾间皮肤表皮与真皮交界处。
[0017]优选地，在奶牛趾间皮肤浸入运输培养基前，使用清水冲洗奶牛蹄部表面污物，再使用质量分数为1～3％葡萄糖酸氯己定清洗奶牛蹄部表面皮肤。
[0018]优选地，所述可行性评估通过以下指标进行评分：皮肤外植体病理组织变化、凋亡相关蛋白Caspase
‑
3表达、TUNEL细胞凋亡检查凋亡率。
[0019]优选地，所述可行性评估的标准为皮肤外植体病理组织检查评分＜3分、凋亡相关蛋白Caspase
‑
3表达阳性综合评分＜6分、细胞凋亡率评分＜3分时的外植体模型认为是可行的。
[0020]本专利技术的有益效果如下：
[0021]本专利技术首次提供了一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法，所构建模型为3D奶牛趾间皮肤模型。该模型相较细胞模型能够更大的维持组织结构的完整性，更真实地模拟皮肤在体环境，同时本外植体模型符合减少、替代、优化等实验动物要求。该模型的构建为深入研究皮肤细胞间的相互作用和细胞信号传导，角质形成细胞的粘附和分化，皮肤屏障功能变化奠定前期基础。
附图说明
[0022]图1为不同时期奶牛趾间皮肤外植体病理学变化(H.E
×
200)图；
[0023]图2为不同时期奶牛趾间皮肤外植体中Caspase
‑
3蛋白的表达(DAB
×
400)图；
[0024]图3为不同时期奶牛趾间皮肤外植体中细胞凋亡情况图，其中每张图中红色为TUNEL染色的凋亡细胞(在每张图的右侧)，蓝色为DAPI染色的全部细胞(在每张图的左侧)，其中图中不清楚的字迹和线条不影响对本专利技术
技术实现思路
的理解。
[0025]图4奶牛趾间皮肤外植体模型组装图。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法，包括以下步骤：
[0027]将奶牛趾间皮肤浸入运输培养基中运输，运输完成后使用洗涤培养基清洗奶牛趾间皮肤，将清洗后的奶牛趾间皮肤培养于含有组织培养基的细胞小室中，完成模型构建，最终对奶牛趾间皮肤外植体模型进行可行性评估；
[0028]所述运输培养基的成分包括DMEM/F
‑
12培养基、青霉素
‑
链霉素
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两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素、L
‑
谷氨酰胺；
[0029]所述洗涤培养基的成分包括DMEM/F
‑
12培养基、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素；
[0030]所述组织培养基的成分包括高糖DMEM培养基，DMEM/F
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12培养基、青霉素
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链霉素
‑
两性霉素B溶液、硫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种奶牛趾间皮肤外植体模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将奶牛趾间皮肤浸入运输培养基中运输，运输完成后使用洗涤培养基清洗奶牛趾间皮肤，将清洗后的奶牛趾间皮肤培养于含有组织培养基的细胞小室中，完成模型构建，最后对奶牛趾间皮肤外植体模型进行可行性评估；所述运输培养基的成分包括DMEM/F
‑
12培养基、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素、L
‑
谷氨酰胺；所述洗涤培养基的成分包括DMEM/F
‑
12培养基、青霉素
‑
链霉素
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两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素；所述组织培养基的成分包括高糖DMEM培养基，DMEM/F
‑
12培养基、青霉素
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链霉素
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两性霉素B溶液、硫酸庆大霉素、L
‑
谷氨酰胺、胎牛血清。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述运输培养基中，硫酸庆大霉素的浓度为4～6μg/mL，所述DMEM/F
‑
12培养基、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B溶液与L
‑
谷氨酰胺的体积比为(97.5～98.5)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述洗涤培养基中，硫酸庆大霉素的浓度为1～3μg/mL，所述DMEM/F
‑
12培养基与青霉素
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑家三，葛延松，张鹤飞，周志新，孙悦，杨春雪，岳洋，范春玲，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：