一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型。本发明专利技术所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型包括：体外共培养的原代血管内皮细胞与原代血管平滑肌细胞；Transwell小室，其底层为聚碳酸酯膜；所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞以所述聚碳酸酯膜相隔，透过所述聚碳酸酯膜形成缝隙连接。本发明专利技术所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，在体外存活时间显著增加，达到3

【技术实现步骤摘要】
一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型及其构建方法


[0001]本专利技术属于心血管疾病领域，涉及一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型。

技术介绍

[0002]高血压是心血管疾病的一个独立危险因素，也是全球心血管死亡的主要原因之一。在中国高血压总体患病率为27.9％，且呈升高趋势，居世界首位。高血压患者呈现的血流动力学特征主要表现为心脏泵血功能增强和全身血管阻力升高。血管阻力的增加是导致高血压发生的直接原因。阻力血管(直径小于400μm)是产生血管阻力的主要血管。在阻力血管中，平滑肌细胞和内皮细胞是调控血管阻力的两大类细胞。这两类细胞的位置和功能各有不同。平滑肌细胞位于阻力血管外侧，有神经纤维分布，不直接接触循环血液。平滑肌细胞的主要功能是收缩血管。内皮细胞位于血管内侧，可直接接触循环血液。内皮细胞的主要功能是释放舒张因子、超极化因子和收缩因子，从而调控平滑肌细胞的收缩。生理情况下，阻力血管平滑肌细胞和内皮细胞共同协调调控血管阻力。因此，研究阻力血管平滑肌细胞和内皮细胞的相互作用的机制将可能为高血压进展的机制提供新信息，为防治高血压进展提供新靶标。
[0003]但是，在动物体内，阻力血管同时受循环因子、交感神经等多种因素的影响，无法观察单一因素的具体作用；同时目前仍无便捷手段在活体动物内分别观察平滑肌细胞和内皮细胞功能。而另一种观察阻力血管功能的方法，离体血管活性实验，虽然可以观察单一因素对血管功能的作用，但是离体血管在体外存活时间短(最长12
‑
24小时)，并且无法分别观察平滑肌细胞和内皮细胞，尤其是单个细胞的生物学特性。
[0004]目前国内外学者仅有对大血管(脐动脉、腹主动脉等)血管平滑肌/内皮细胞共培养，尚无阻力血管平滑肌/内皮细胞的共培养模型。造成模型成功困难的主要原因为：1.肠系膜阻力血管，血管极细，直径小于400μm，需在体视学显微镜下进行；2.高血压动物的阻力血管较正常动物血管管壁僵硬，管腔变窄；血管周围脂肪组织减少，萎缩，显微镜下血管固有细胞数量减少，体积变小，造成了分离纯化操作困难；3.正常内皮细胞和平滑肌细胞是终末分化细胞，不易传代和扩增培养，故小鼠的阻力血管平滑肌/内皮细胞共培养更加困难。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于构建一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，该体外模型有助于体外模拟动物体内的阻力血管状态，研究阻力血管细胞相互作用机制，高通量筛选有前景的治疗高血压的药物，研究潜在高血压药物的作用机制，为研究高血压发生、发展、治疗提供了新的工具和方法。
[0006]本专利技术所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型包括：体外共培养的原代血管内皮细胞与原代血管平滑肌细胞；Transwell小室，其底层为聚碳酸酯
膜；所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞以所述聚碳酸酯膜相隔，透过所述聚碳酸酯膜形成缝隙连接。
[0007]根据本专利技术所述的体外模型的进一步特征，所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞均来自小鼠肠系膜二级动脉。
[0008]根据本专利技术所述的体外模型的进一步特征，所述原代血管内皮细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的上层，所述原代血管平滑肌细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的下层。
[0009]本专利技术还提供了所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的构建方法。
[0010]本专利技术所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的构建方法包括以下步骤：
[0011]A.原代血管平滑肌细胞的提取；
[0012]B.原代血管内皮细胞的提取；
[0013]C.取Transwell小室，倒扣于培养皿内，在倒扣的小室顶面接种步骤A所提取的原代血管平滑肌细胞；
[0014]D.反转所述的Transwell小室，将其正置于培养板中，在其底层上接种步骤B所提取的原代血管内皮细胞；
[0015]E.共培养后取所述Transwell小室的底层的部分聚碳酸酯膜，染色观察血管内皮细胞与血管平滑肌细胞透过聚碳酸酯膜的缝隙形成连接状态，所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型已经构建完成。
[0016]根据本专利技术所述的构建方法的进一步特征，所述步骤A包括以下步骤：
[0017]a.分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，剔除周边脂肪和结缔组织，用HBSS
‑
1缓冲液清除动脉腔内血液；
[0018]b.用第一消化酶(2mg胶原酶+2ml HBSS
‑
2缓冲液)溶液消化肠系膜上动脉及其分支血管；所述第一消化酶溶液为每毫升HBSS
‑
2缓冲液含有1mg胶原酶；
[0019]c.去除外膜，在解剖显微镜下纵向切开血管，刮拭内膜表面，除去内皮；
[0020]d.将血管转移到第二消化酶液中消化；所述第二消化酶溶液为每毫升HBSS
‑
2缓冲液含有1mg胶原酶和0.5mg弹性蛋白酶；
[0021]e.重悬，分离出所述的原代血管平滑肌细胞。
[0022]根据本专利技术所述的构建方法的进一步特征，所述步骤B包括以下步骤：
[0023]a.分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，分离血管周围静脉和脂肪。
[0024]b.将离体的血管放入含0.02％胶原酶的内皮细胞基础培养基中消化，分离出所述的原代血管内皮细胞。
[0025]根据本专利技术所述的构建方法的进一步特征，在所述步骤C之前预处理所述的Transwell小室，在其侧孔中加入纤连蛋白溶液，覆盖于小室底部的聚碳酸酯膜上，风干45分钟。
[0026]根据本专利技术所述的构建方法的进一步特征，所述步骤C中，在每毫升含10％胎牛血清的DMEM培养液中接种1.5
×
104个平滑肌细胞。
[0027]根据本专利技术所述的构建方法的进一步特征，所述步骤D中，在每毫升含10％胎牛血清、1％牛脑提取液内皮生长因子的DMEM培养液中接种3
×
104个血管内皮细胞。
[0028]根据本专利技术所述的构建方法，需要翻转transwell小室，在小室底部接种细胞时，液体容易溢出，导致接种细胞及培养液流失。因此本专利技术人进一步改进了方法，所述步骤C中，另取一个同样的Transwell小室，切去其底部的聚碳酸酯膜，叠放在已倒扣的Transwell小室上，从而防止液体流失，保证接种细胞密度。
[0029]本专利技术所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，具体以下有益效果：(1)与离体血管相比，该体外模型在体外存活时间显著增加，达到3
‑
7天；(2)该模型可重复性好，并且容易批量构建；(3)可在单一因素刺激后，分别观察平滑肌细胞内皮细胞蛋白表达或功能变化情况；(4)可选择性在平滑肌细胞或内皮细胞侧给药，观察其对细胞蛋白表达或功能的作用。
[0030]因此，本专利技术所述的模拟阻力血管平滑肌细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，其特征在于，包括：体外共培养的原代血管内皮细胞与原代血管平滑肌细胞；Transwell小室，其底层为聚碳酸酯膜；所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞以所述聚碳酸酯膜相隔，透过所述聚碳酸酯膜形成缝隙连接。2.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于：所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞均来自小鼠肠系膜二级动脉。3.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于：所述原代血管内皮细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的上层，所述原代血管平滑肌细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的下层。4.如权利要求1所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.原代血管平滑肌细胞的提取；B.原代血管内皮细胞的提取；C.取Transwell小室，倒扣于培养皿内，在倒扣的小室顶面接种步骤A所提取的原代血管平滑肌细胞；D.反转所述的Transwell小室，将其正置于培养板中，在其底层上接种步骤B所提取的原代血管内皮细胞；E.共培养后取所述Transwell小室的底层的部分聚碳酸酯膜，染色观察血管内皮细胞与血管平滑肌细胞透过聚碳酸酯膜的缝隙形成连接状态，所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型已经构建完成。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤：a.分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，剔除周边脂肪和结缔组织，用HBSS
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1缓冲液清除动脉腔内血液；b.用第一消化酶(2mg胶原酶+2ml HBSS
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹维，周展眉，吴丽玲，苏彩玲，苏焕娟，阳知辰，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：