间充质干细胞的培养方法及应用技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及应用。所述间充质干细胞的培养方法，包括间充质干细胞原代细胞的提取、间充质干细胞原代细胞的培养扩增以及间充质干细胞的分离等步骤。本发明专利技术提供了一种间充质干细胞的培养方法，生产成本低，过程简单，易于操作，培养出来的干细胞可用于生产组织和细胞。织和细胞。

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞的培养方法及应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的一类干细胞，存在于多种成体的组织内，如骨髓、脂肪组织、牙齿组织、胰腺、皮肤、外周血、脐带组织和胎盘等等。在一定条件下，间充质干细胞不仅可分化为中胚层来源细胞，还可分化为内胚层和外胚层来源细胞，例如神经元、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、胰岛细胞、脂肪细胞和肺上皮细胞等。除了具有多向分化的能力外，间充质干细胞还具有营养和支持作用。间充质干细胞可以通过分泌大量生长因子、趋化因子、白介素等与造血干细胞相互作用，从而维持体内造血系统的稳态。间充质干细胞的营养功能可以帮助组织愈合和再生，通过分泌生长因子和神经营养因子来改善疾病。
[0003]间充质干细胞最具有临床价值的方面是其具有调节免疫系统的作用。间充质干细胞表面一般不表达MHCⅡ类分子或共刺激分子，且可以与多种固有或适应性免疫细胞相互作用，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞。间充质干细胞表面表达大量趋化因子受体，促使其可以沿着毛细血管迁移到受损或病变部位，对损伤部位进行修复。间充质干细胞还具有容易转染外源基因，促进干细胞植入等特性，是细胞治疗、组织工程研究中一种中药的种子细胞和基因治疗载体，在再生医学和细胞疗法中具有特殊的应用价值。
[0004]无血清培养基，是指在细胞培养中不需要添加动物或人源血清。但为了满足细胞生长的需要，通常会向培养基中添加替代血清功能的原料，主要包括结合蛋白、生长因子、粘附因子、激素、微量元素等加大类别。目前市面上的无血清培养基，牛血清白蛋白或人血清白蛋白是基础成分中的必须原料，添加比例大，成本高，但具有细胞传代及扩增能力不足的缺点。
[0005]专利技术专利CN 101525594B公开了一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和用该培养基培养间充质干细胞的方法，该完全培养基包括细胞基础培养基和终浓度为胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。该专利技术的低血清浓度完全培养基虽然达到了与使用高血清浓度培养试剂持平甚至更好的促进细胞增殖的作用，但是培养基中含有胎牛血清，其成分复杂且含有异种蛋白质，容易携带病毒或被支原体感染，而且胎牛血清生产批次间差异较大，来源不稳定，对体外大规模培养扩增间充质干细胞工艺影响较大。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术提供了一种间充质干细胞的培养方法及应用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0009]S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
[0010]S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合60
‑
80％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入1
‑
3mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化2
‑
5min，细胞收缩变圆后加入3
‑
8mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1000
‑
1800rpm的转速离心4
‑
8min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗1
‑
3次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1
‑
1.5接种至10cm细胞培养皿中，于30
‑
40℃、4
‑
7％CO2及饱和湿度条件下进行培养2
‑
6天后，细胞融合65
‑
75％时以1：5
‑
8的比例传代至15cm细胞培养皿中；
[0011]S3、间充质干细胞的分离：每隔二到五天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
[0012]所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞、牙髓间充质干细胞原代细胞、脐带间充质干细胞原代细胞、胎盘间充质干细胞原代细胞或脂肪间充质干细胞原代细胞中的任意一种。
[0013]所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
[0014]H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
[0015]H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入4
‑
8mL原代培养基至没过组织块，于30
‑
40℃、4
‑
7％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养3
‑
7天，得到间充质干细胞原代细胞；
[0016]所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
[0017]所述无血清培养基，包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、L
‑
谷氨酰胺、胰蛋白酶抑制剂、3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β
‑
巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。
[0018]间充质干细胞在分离提取的过程中面临严重的低氧环境，导致细胞的存活率低，通常在缺氧状态下，引入抗氧化剂对细胞进行抗氧化、抗凋亡保护。
[0019]所述无血清培养基还包括抗氧化剂。
[0020]所述无血清培养基，以培养基的终浓度计，6
‑
13mg/L非必需氨基酸、3
‑
8mg/L L
‑
谷氨酰胺、7
‑
12mg/L 3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤、8
‑
15mg/L重组人血清白蛋白、5
‑
11mg/L转铁蛋白、1
‑
3mg/L还原性谷胱甘肽、0.3
‑
0.8μg/L亚硒酸钠、8
‑
12mg/L胰岛素、6
‑
13μg/L氢化可的松、1
‑
2mg/Lβ
‑
巯基乙醇、1
‑
3mg/L青链霉素、7
‑
14μg/L重组人表皮生长因子、6
‑
12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、3
‑
7mg/L抗氧化剂。
[0021]所述抗氧化剂为芒果叶提取物、虾青素、改性虾青素中的一种或多种。
[0022]所述抗氧化剂为芒果叶提取物。
[0023]所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后用中药粉碎机粉碎，过40
‑
80目筛，然后用65
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、间充质干细胞原代细胞的提取；S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增；S3、间充质干细胞的分离。2.如权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞、牙髓间充质干细胞原代细胞、脐带间充质干细胞原代细胞、胎盘间充质干细胞原代细胞或脂肪间充质干细胞原代细胞中的任意一种。3.如权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合60
‑
80％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入胰蛋白酶消化，细胞收缩变圆后加入上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液离心，弃掉上清液，用PBS离心漂洗，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1
‑
1.5接种至细胞培养皿中，于30
‑
40℃、4
‑
7％CO2及饱和湿度条件下进行培养2
‑
6天后，细胞融合65
‑
75％时以1：5
‑
8的比例传代至细胞培养皿中。4.如权利要求3所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述无血清培养基，包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、L
‑
谷氨酰胺、胰蛋白酶抑制剂、3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β
‑
巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。5.如权利要求4所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述无血清培养基还包括抗氧化剂。6.如权利要求5所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述抗氧化剂为芒果叶提取物、虾...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赢滢，姜舒，张芸，赵传鑫，李欣，
申请(专利权)人：深圳市茵冠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：