一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法技术

本发明专利技术属于干细胞培养技术领域，尤其为一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，包括牙髓组织，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10

【技术实现步骤摘要】
一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，具体为一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]牙髓干细胞是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。对牙髓干细胞的研究显示，牙髓干细胞可应用于牙髓再生、牙本质再生、骨骼再生、神经细胞再生、心肌和血管再生等。牙髓干细胞的应用于牙科诊疗，可以促进牙本质再生，从单一牙齿分离获取大量的牙髓干细胞可以应用牙科进行大量的牙齿修复；目前的培养方法大多添加胎牛血清，但临床使用含动物源的培养基不仅会引起免疫排斥反应，异源病毒感染，而且采用这种培养基培养的牙髓干细胞，生长比较缓慢；而且胎牛血清具有污染源性，批次间稳定性差，不利于细胞用于动物模型中。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，解决了目前的培养方法大多添加胎牛血清，导致污染性强以及不利于细胞用于动物模型中的问题。
[0005](二)技术方案
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，包括牙髓组织，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃， 200rpm消化10
‑
20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，得到牙髓干细胞；并将牙髓干细胞放置在培养皿中备用；然后制备温和培养液和牙髓干细胞原代培养液。
[0007]作为本专利技术的一种优选技术方案，温和培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和BMP
‑
2组成。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，温和培养液中的bFGF和BMP
‑
2的质量比为(8～12)：(8～12)。
[0009]作为本专利技术的一种优选技术方案，牙髓干细胞原代培养液由α
‑
MEM培养基、体积分数为20％的胎牛血清、摩尔浓度为2mM/L的L
‑
谷氨酰胺、0.25mg/ml 的两性霉素B、0.1mM/L的L
‑
抗坏血酸
‑
2磷酸钠、100IU/ml青霉素，100IU/ml 链霉素组成。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，牙髓干细胞传代培养液为无血清培养基。
[0011]作为本专利技术的一种优选技术方案，将牙髓干细胞以温和培养液为初次培养液进行基质传代培养。
[0012]作为本专利技术的一种优选技术方案，将权6中培养后的牙髓干细胞放置在牙髓干细胞原代培养液进行二次培养。
[0013]作为本专利技术的一种优选技术方案，牙髓干细胞培养密度为2
×
103/c
㎡‑5ꢀ×
103/c
㎡
。
[0014](三)有益效果
[0015]与现有技术相比，本专利技术提供了一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，具备以下有益效果：
[0016]该自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，采用温和培养液和牙髓干细胞原代培养液，保证了细胞间信息信号的传递，使得牙髓干细胞更容易在胶原凝胶内的分裂增殖。由于载体创建的细胞生长环境能够最大程度地模拟体内环境，因此细胞的生长更加健康；避免培养过程中产生髓干细胞的污染，而且有效的提高了整体的生长速度。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]实施例1
[0019]本专利技术提供以下技术方案：一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，包括牙髓组织，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化 10
‑
20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，得到牙髓干细胞；并将牙髓干细胞放置在培养皿中备用；然后制备温和培养液和牙髓干细胞原代培养液。
[0020]具体的，温和培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和 BMP
‑
2组成。
[0021]具体的，温和培养液中的bFGF和BMP
‑
2的质量比为(8～12)：(8～12)。
[0022]具体的，牙髓干细胞原代培养液由α
‑
MEM培养基、体积分数为20％的胎牛血清、摩尔浓度为2mM/L的L
‑
谷氨酰胺、0.25mg/ml的两性霉素B、0.1mM/L 的L
‑
抗坏血酸
‑
2磷酸钠、100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素组成。
[0023]具体的，牙髓干细胞传代培养液为无血清培养基。
[0024]具体的，将牙髓干细胞以温和培养液为初次培养液进行基质传代培养。
[0025]具体的，将权6中培养后的牙髓干细胞放置在牙髓干细胞原代培养液进行二次培养。
[0026]具体的，牙髓干细胞培养密度为2
×
103/c
㎡‑5×
103/c
㎡
。
[0027]本实施方案中，将牙髓组织剪碎，放置50ml离心管中，加入10倍体积的3g/L I型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、 200rpm消化10～20min左右，加入等体积的DMEM培养液终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm 离心5min。丢弃上清，用30ml PBS清洗沉淀1次，1000rpm离心5min。沉淀用无血清培养基重悬，以0.5
×
104个/c
㎡
～1
×
104个/c
㎡
接种至六孔板中，每孔加入2ml含有20％FBS的DMEM培养基，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，3
‑
7d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％
‑
90％汇合时(约经过12d)。
[0028]实施例2
[0029]本专利技术提供以下技术方案：一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，包括牙髓
组织，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化 10
‑
20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，得到牙髓干细胞；并将牙髓干细胞放置在培养皿中备用；然后制备温和培养液和牙髓干细胞原代培养液。
[0030]具体的，温和培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和 BMP
‑
2组成。
[0031]具体的，温和培养液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，包括牙髓组织，其特征在于：取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10
‑
20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，得到牙髓干细胞；并将牙髓干细胞放置在培养皿中备用；然后制备温和培养液和牙髓干细胞原代培养液。2.根据权利要求1所述的一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，其特征在于：温和培养液由DMEM/F12无血清培养液、血清替代物、bFGF和BMP
‑
2组成。3.根据权利要求2所述的一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，其特征在于：温和培养液中的bFGF和BMP
‑
2的质量比为(8～12)：(8～12)。4.根据权利要求1所述的一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，其特征在于：牙髓干细胞原代培养液由α
‑
MEM培养基、体积分数为20％的胎牛血清、...

【专利技术属性】
技术研发人员：占震锋，李庆静，
申请(专利权)人：上海南滨江细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：