一种肌肉干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术提供了一种肌肉干细胞的分离培养方法。包括以下步骤：S1：对肌肉样本进行消毒、清洗，得到肌肉组织；S2：加入消化酶对肌肉组织进行消化处理，得到单细胞混合物；S3：将单细胞混合物接种在细胞培养容器内，加入细胞培养基进行差速贴壁培养，得到纯化的肌肉干细胞；S4：对纯化的肌肉干细胞进行传代培养。通过该方法可获得大量稳定表达肌肉干细胞标志物Pax7的肌肉干细胞，同时保持体外增殖以及自我更新的能力，激发了其分化潜能，可以广泛应用于细胞治疗、组织工程、分子生物学等研究领域。分子生物学等研究领域。

【技术实现步骤摘要】
一种肌肉干细胞的分离培养方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，尤其涉及一种肌肉干细胞的分离培养方法。

技术介绍

[0002]肌营养不良症是由编码细胞骨架和膜蛋白的基因的功能丧失突变引起的，最常见的为杜氏肌营养不良症(DMD)。骨骼肌由大的多核纤维组成，其细胞核不能分裂。由于无法由数亿个有丝分裂后细胞核中恢复正确的基因表达，肌营养不良症成为了最难治疗的疾病之一。
[0003]骨骼肌自身具有很强的组织扩张和修复潜力，这依赖于常驻的肌肉干细胞(Muscle stem cells,MuSCs)，也称为“卫星细胞”(Satellite cells,SCs)，即位于基底层和肌纤维膜之间的肌源性祖细胞。未受伤肌肉中静止的SCs在受伤或疾病时被激活(Sara Ancel,Stuelsatz Pascal,Feige N Jerome.Muscle stem cell quiescence:controlling stemness by staying asleep.Trends Cell Biol.2021 Jul；31(7):556
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568.)。激活后，SCs进行增殖扩张，产生一系列肌肉祖细胞，这些细胞随后融合形成功能性多核肌纤维(Snow,1978)。卫星细胞被认为在成体肌肉中形成稳定的、自我更新的干细胞池，它们在组织生长和修复中发挥作用(Sesillo B Francesca,Fox David,Sacco Alessandra.Muscle stem cells give rise to rhabdomyosarcomas in a severe mouse model of duchenne muscular dystrophy.Cell Rep.2019 Jan 15；26(3):689
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701.)。但由于老龄化肌肉萎缩以及一些疾病的影响，可能会导致肌肉干细胞的再生修复能力下降丧失，最终导致病人瘫痪甚至死亡。
[0004]干细胞技术是通过同种异体卫星细胞或基因矫正自体卫星细胞的移植来调控细胞扩增和分化修复人体损伤组织或抵抗衰老，因此，是治疗遗传性肌肉疾病(例如DMD)的一种很有前景的方法。但在干细胞移植中存在一些问题，限制了其发展，主要包括以下几个方面：
[0005](1)无法产生大量具有自我更新和分化潜力的可移植干细胞。一般来说，肌肉干细胞在体外培养3
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5代左右，会发生细胞分化，无法继续传代。而供体SCs对肌肉再生的贡献与移植的细胞数量密切相关。因此，治疗性SCs植入所需的数量以及细胞的体外培养技术，是干细胞治疗的重要元素(Charville W Gregory,Cheung H Tom,Yoo Bryan et al.Ex vivo expansion and in vivo self
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renewal of human muscle stem cells.Stem Cell Reports.2015 Oct 13；5(4):621
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32.)。
[0006](2)移植后的肌肉干细胞转化率低下。移植后的肌肉干细胞不能有效的转化为目的细胞，不能充分发挥肌肉干细胞的作用。因此，如何维持肌肉干细胞的再生能力和分化潜力，以实现大量培养肌肉干细胞和移植后的肌肉干细胞转化是我们急需解决的问题。而造成该问题的原因主要有以下几个方面：
[0007](1)肌肉干细胞数量少：在成人体内，肌肉干细胞的数量非常少，而且细胞数量随着年龄增长会出现降低，从而增加了分离难度。
[0008](2)肌肉干细胞纯度低：很多情况下获得的肌肉样本会混杂有大量的肌纤维细胞、结缔组织等成分，从而增加了纯化的难度。当肌肉干细胞不纯时，在进行移植后，不能有效的发育成肌肉纤维，从而影响治疗效果。
[0009](3)肌肉干细胞难维持和培养：肌肉干细胞贴壁速度慢，对培养基、培养环境很敏感，许多标准细胞培养的技巧方法并不适用于干细胞，而且由于干细胞机制至今了解并不多，因此，在未分化状态，哪些培养物和材料能最好的诱导细胞，是很难预测的，同时，由于同一培养机制对于不同的细胞系具有不同的效果，在选择培养基和其它介质的时候，需要筛选和试验细胞外基质的组分，为干细胞的培养提供必需的营养物质，促进肌肉干细胞的增殖和防止干细胞分化。

技术实现思路

[0010]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种肌肉干细胞的分离培养方法，其解决了现有技术中存在的无法产生大量具有自我更新和分化潜力的可移植肌肉干细胞的问题。
[0011]本专利技术一方面提供一种肌肉干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0012]S1：对肌肉样本进行消毒、清洗，得到肌肉组织；
[0013]S2：加入消化酶对肌肉组织进行消化处理，得到单细胞混合物；
[0014]S3：将单细胞混合物接种在细胞培养容器内，加入细胞培养基进行差速贴壁培养，得到纯化的肌肉干细胞；
[0015]S4：对纯化的肌肉干细胞进行传代培养。
[0016]有益效果：对肌肉样本进行消毒有利于去除细菌和病毒，避免肌肉样本因受到感染而失去增殖和分化的能力，甚至死亡；对肌肉样本进行清洗有利于除去杂质，比如脂肪、粘膜等非肌肉组织等。利用消化酶可以消化肌肉组织。根据肌肉干细胞和单细胞混合物中其他细胞的贴壁速度的时间差异，进行差速贴壁培养，分离得到纯化的肌肉干细胞。通过传代培养对肌肉干细胞进行扩大培养，从而获得大量具有自我更新和分化潜力的可移植肌肉干细胞。
[0017]进一步地，步骤S2中，所述消化酶包括分散酶和胰酶替代物，所述分散酶为I型胶原蛋白酶和中性蛋白酶II的混合酶。
[0018]进一步地，步骤S2中，I型胶原蛋白酶的终浓度为0.1％～0.5％、中性蛋白酶II的终浓度为2～5mg/mL、胰酶替代物的终浓度为1％～5％。
[0019]有益效果：在此浓度范围内效果最好，当浓度高于此浓度时，对干细胞的活性损伤较大，不利于保持肌肉干细胞的完整性；当浓度低于此浓度时，不利于组织的消化。
[0020]进一步地，步骤S2中，消化时间为0.5～1小时，消化温度为37℃。
[0021]进一步地，步骤S3中，所述细胞培养基为无血清培养基。
[0022]有益效果：无血清培养基避免了引入动物源性成分，从而避免了肌肉干细胞产生免疫原性，从而避免了移植后机体后产生的免疫排斥反应。
[0023]进一步地，所述无血清培养基包括基础培养基和添加物，其中，所述基础培养基包括血清替代物，所述添加物包括谷氨酰胺和人重组表皮生长因子。
[0024]有益效果：所述培养基不仅可促进肌肉干细胞的增殖和增强其自我更新能力，同
时可保持肌肉干细胞的分化潜力，同时，谷氨酰胺和人重组表皮生长因子具有协同增效作用。
[0025]进一步地，所述血清替代物的浓度为15％～20％、谷氨酰胺的浓度为0.5％～1％、人重组表皮生长因子的浓度为100～150ng本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肌肉干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：对肌肉样本进行消毒、清洗，得到肌肉组织；S2：加入消化酶对肌肉组织进行消化处理，得到单细胞混合物；S3：将单细胞混合物接种在细胞培养容器内，加入细胞培养基并进行差速贴壁培养，得到纯化的肌肉干细胞；S4：对纯化的肌肉干细胞进行传代培养。2.如权利要求1所述的一种肌肉干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S2中，所述消化酶包括分散酶和胰酶替代物，所述分散酶为I型胶原蛋白酶和中性蛋白酶II的混合酶。3.如权利要求2所述的一种肌肉干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S2中，I型胶原蛋白酶的终浓度为0.1％～0.5％、中性蛋白酶II的终浓度为2～5mg/mL、胰酶替代物的终浓度为1％～5％。4.如权利要求3所述的一种肌肉干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S2中，消化时间为0.5～1小时，消化温度为37℃。5.如权利要求1所述的一种肌肉干细胞的分离培养方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟晓东，戴晓宇，付强，邓恩杰，白希，
申请(专利权)人：重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：