一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及干细胞技术领域，具体涉及一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法。采用DMEM LG/F12基础培养基，10%人血小板裂解液，10

【技术实现步骤摘要】
一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及干细胞
，具体涉及一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]膝关节炎是老年人群中的高发疾病，60岁以上发病率60%，75岁以上发病率高达80%。随着社会人口的老龄化及人们对于生活质量的要求越来越高，膝关节炎已成为人们较为关注的慢性疾病，研究它的治疗方法成为许多医学专家们的重要课题。近年来，利用干细胞再生医学治疗膝关节炎，已经获得了很多的临床案例，通过诱导干细胞，迅速分化成为成骨细胞或软骨细胞，修复受损组织，缓解病痛，治疗膝关节炎，取得了很好的效果。
[0003]脐带来源间充质干细胞是从脐带中分离出来的一种成体干细胞，因其来源广泛、取材方便、免疫原性弱、増殖能力强的优势被广泛的应用于临床研究。可在微环境作用下归巢到损伤部位并分化为特异的组织细胞，分泌大量活性物质，具有创伤修复、免疫调节能力，有效的回避了胚胎干细胞涉及的伦理问题，也避免了类似诱导多能干细胞因复杂的诱导转分化机制所带来的安全性和风险问题。
[0004]申请号为201810692499.5的中国专利公开了用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用，将间充质干细胞与滑膜细胞进行间接共培养，收获共培养后的间充质干细胞冻存；滑膜细胞与脐带间充质干细胞按照4:1的密度比例接种进行共培养后所获得的脐带间充质干细胞在相同的诱导条件下更易向软骨方向分化，通过关节腔注射该制剂有效促进关节软骨损伤/缺损的修复，治疗效果明显优于单纯的间充质干细胞制剂。
[0005]申请号为201210410047.6的中国专利公开了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用，具体提供了向软骨细胞分化的脐带间充质干细胞的制备方法。采用该的方法构建的无支架软骨可用于受损关节软骨的修复。
[0006]上述现有技术中，通过培养间充质干细胞并对其进行诱导实现了对关节软骨损伤的修复，但在上述培养过程中，采用的培养基均为含血清培养基，血清在为细胞生长和增殖提供必要养分的同时，还存在不同批次有差异、工作量大、其成分无法保证以及被病毒和支原体感染的几率大的缺陷。

技术实现思路

[0007]为了规避血清在大批量细胞培养过程中成分的不确定性，批间差异大的问题，本专利技术提供了一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法，本专利技术采用DMEM LG/F12基础培养基，10%人血小板裂解液，10
µ
g/L碱性成纤维细胞生长因子作为培养液；由地塞米松10nM，维生素C 25μg/mL和β
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甘油磷酸盐2mM作为成软骨诱导分化剂，成功实现了对脐带间质干细胞的培养。
[0008]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：
一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制备方法，包括以下步骤：S1、采集与分离：取脐带组织，剪成小段，洗去组织块表面杂质，转移至培养皿，剖离出华通氏胶将其置于生理盐水中，分离成组织块，转移至培养瓶中；S2、原代培养：将其置于培养箱中静置培养，培养10
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20天后得到P0代脐带间充质干细胞，观察细胞的生长情况，待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合70
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90%，细胞状态良好，对细胞进行传代扩增；S3、传代培养：吸取全部培养上清，加入生理盐水，晃动清洗细胞，吸取培养瓶内生理盐水废液，加入Tryple细胞消化液，持续晃动培养瓶至全部细胞呈沙状重悬；待无明显细胞团块时，将细胞悬液转移到离心管中；用生理盐水冲洗全部培养瓶，并将冲洗液加入到离心管中，混合均匀，加入培养液重悬细胞，接种至新的培养瓶，加入含有成软骨诱导分化剂的培养液，放置于培养箱中培养；S4、细胞冻存：细胞冻存液的制备：在含有成软骨诱导分化剂的培养液中加入浓度为DMSO，混合均匀后放4℃预冷，备用；取对数生长后期的细胞，制备单细胞悬液，合并至离心管，加入冻存液重悬细胞；将细胞分装至冻存管中冻存。
[0009]本专利技术具有如下有益效果：1.在培养过程中，使用Tryple作为细胞消化液，不需要胰酶抑制剂终止消化，避免了与血清的直接接触，血清中的复杂成分也不会干扰细胞潜在的生理功能，改变细胞分裂的正常状态；2.本专利技术使用的无血清培养液能够达到与对比例中含有血清的培养液同样的培养效果；由于使用的培养液其成分明确，相对于含胎牛血清的培养液而言，避免了动物外源物的引入，能够最大限度的规避血清为细胞培养带来的风险。
具体实施方式
[0010]下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0011]实施例一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制备方法，包括以下步骤：S1、采集与分离：取脐带组织，剪成小段，洗去组织块表面杂质，转移至培养皿，剖离出华通氏胶将其置于生理盐水中，用组织剪将其分离成1
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3mm3组织块，将其转移至培养瓶中，补加培养液并使其分散均匀；S2、原代培养：将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养，每3天更换一次培养液，培养10
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20天后得到P0代脐带间充质干细胞；用倒置显微镜观察细胞的生长情况，待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合70
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90%，细胞状态良好，对细胞进行传代扩增；S3、传代培养：使用移液管吸取全部培养上清，每瓶加入10mL生理盐水，盖紧培养瓶盖晃动清洗细胞，打开瓶盖吸取培养瓶内生理盐水废液，向其中加入1mL Tryple细胞消
化液，持续晃动培养瓶至全部细胞呈沙状重悬；待无明显细胞团块时，将细胞悬液转移到离心管中；用生理盐水冲洗全部培养瓶，并将冲洗液加入到离心管中，混合均匀，加入培养液重悬细胞，接种至新的培养瓶，加入含有成软骨诱导分化剂的培养液，放置于37℃ 5%CO2培养箱中培养；S4、细胞冻存：细胞冻存液的制备：在含有成软骨诱导分化剂的培养液中加入浓度为DMSO，混合均匀后放4℃预冷，备用；取对数生长后期的细胞，制备单细胞悬液，合并至离心管，加入冻存液重悬细胞；将细胞分装至冻存管中冻存，冻存条件为：将冻存管放入预冷温度为
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20℃的程序降温盒中，
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80℃过夜后，转入液氮罐于
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196℃中保存。
[0012]上述培养过程中，培养液为：DMEM LG/F12基础培养基，10%人血小板裂解液，10
µ
g/L碱性成纤维细胞生长因子；成软骨诱导分化剂由地塞米松10nM，维生素C 25μg/ mL和β
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甘油磷酸盐2mM组成。
[0013]一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂，该制剂由上述制备方法制备的干细胞制备而成，其干细胞制剂的制备方法为：从液氮罐中取出待复苏的细胞，将冻存的细胞浸入42℃水浴锅复苏，顺时针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集与分离：取脐带组织，剪成小段，洗去组织块表面杂质，转移至培养皿，剖离出华通氏胶将其置于生理盐水中，分离成组织块，转移至培养瓶中；S2、原代培养：将其置于培养箱中静置培养，培养10
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20天后得到P0代脐带间充质干细胞，观察细胞的生长情况，待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合70
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90%，细胞状态良好，对细胞进行传代扩增；S3、传代培养：吸取全部培养上清，加入生理盐水，晃动清洗细胞，吸取培养瓶内生理盐水废液，加入Tryple细胞消化液，持续晃动培养瓶至全部细胞呈沙状重悬；待无明显细胞团块时，将细胞悬液转移到离心管中；用生理盐水冲洗全部培养瓶，并将冲洗液加入到离心管中，混合均匀，加入培养液重悬细胞，接种至新的培养瓶，加入含有成软骨诱导分化剂的培养液，放置于培养箱中培养；S4、细胞冻存：细胞冻存液的制备：在含有成软骨诱导分化剂的培养液中加入浓度为DMSO，混合均匀后放4℃预冷，备用；取对数生长后期的细胞，制备单细胞悬液，合并至离心管，加入冻存液重悬细胞；将细胞分装至冻存管中冻存。2.根据权利要求1所述的一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制备方法，其特征在于，培养箱的培养条件为：3...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜浩为，李慧娟，
申请(专利权)人：深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：