一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基及培养方法技术

本发明专利技术提供一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基及培养方法，步骤一：选取胎盘绒毛膜干细胞作为培养CD106阳性细胞的初始细胞；步骤二：通过配置上述的一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基，将胎盘绒毛膜干细胞置于上述培养基进行表达培养，在培养过程中使得胎盘绒毛膜干细胞始终处于CD106表达状态，并使得胎盘绒毛膜干细胞CD106表达比例持续增加。从胎盘组织中提取绒毛膜层细胞，CD106初始表达较高，CD106更容易高表达，研发的无血清定向培养基，使每批次细胞增殖效率高及CD106表达稳定，减少CD106表达的波动性，使临床使用成为可能。在使用前24小时加入TNF

【技术实现步骤摘要】
一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，具体为一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cells，MSCs)具有造血支持和免疫调节的独特属性，并且在体外可定向诱导向成脂、成骨和成软骨分化，因此在组织修复和多系统疾病治疗中具有良好的应用前景。CD106，又称为血管细胞黏附分子
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1(vascular celladhesion molecule
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1，VCAM
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1)，作为一种跨膜糖蛋白，CD106的表达主要与免疫应答调节和促血管新生功能相关。多种组织来源的MSCs均含有较低比例的CD106阳性细胞，例如骨髓、脐带、羊膜、脂肪、胎盘绒毛膜等。同时，在再生障碍性贫血骨髓来源的MSCs中，CD106含量异常低，存在多种生物学功能缺陷，尤其是免疫抑制功能显著降低。研究发现，高活性CD106阳性MSCs具有较强的免疫调节和促血管新生能力。因此，有效提高CD106在MSCs的表达丰度，将会使MSCs具有更强的免疫调节和促血管新生能力。
[0003]目前与CD106阳性细胞相关专利有CN202010112051.9《一种提高从人脐带间充质干细胞纯化CD106阳性亚群比例的方法》此专利采用先培养再从中获取分离出CD106阳性细胞，实际并未促进CD106阴性细胞表达CD106，只是维持CD106细胞存活状态并从中挑选出CD106阳性细胞，在普通的培养基中CD106阳性细胞比例只能维持现状甚至降低。
[0004]CN201910348027.2《一种可提高脐带间充质干细胞CD106和CD54亚群比例的培养基》此专利CD106表达波动较大,CD106表达在20～86％之间，TNF
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α使用浓度范围较大，且含有胎牛血清，难以实际应用。
[0005]CN202010409889.4《一种制备CD106高表达间充质干细胞的方法、间充质干细胞及其应用和定向培养基》由脐带间充质干细胞经细胞因子刺激转变，刺激程度较大，CD106表达不够高，且含有胎牛血清，容易造成批间不稳定。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基及培养方法。
[0007]为达成上述目的，本专利技术提出如下技术方案：一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基，包含90～95％的DMEM/12、5
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10％血清替代物，并添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、地塞米松和白介素10(IL10)。
[0008]优选的，所述地塞米松的用量为10^
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10～10^
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11mol/L，EGF的用量为10～40ng/ml，bFGF的用量为5～15ng/ml，IL10的用量为20～60ng/ml。
[0009]优选的，包括如下步骤：
[0010]步骤一：选取胎盘绒毛膜干细胞作为培养CD106阳性细胞的初始细胞；
[0011]步骤二：通过配置上述的一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基，将胎盘绒毛膜干细胞置于上述培养基进行表达培养，在培养过程中使得胎盘绒毛膜干细胞始终处于CD106表达的状态，并使得胎盘绒毛膜干细胞CD106表达比例持续增加，最终达到CD
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106表达高于85％的状态。
[0012]优选的，步骤一的具体操作为：
[0013]取新鲜胎盘，从胎膜中分离出绒毛膜层，使用组织剪将绒毛膜层剪碎成肉糜状，再使用4ng/ml的胶原酶II与组织混合，比例为按5g组织使用10ml胶原酶II，并在恒温摇床消化1小时，设置温度参数为37℃、转速参数为150RPM，消化完成后使用输血器过滤掉残余组织，将细胞悬液使用生理盐水清洗两遍，即可获得胎盘绒毛膜干细胞，部分杂细胞将在传代时剔除。
[0014]优选的，步骤二的具体操作为：
[0015]将步骤一获得的胎盘绒毛膜干细胞置于定向培养基，培养于175培养瓶中，培养基采用包含90～95％的DMEM/12和5
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10％血清替代物，血清替代物为Helios UltraGRO血清替代物，并添加地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、白介素10(IL10)，接种第二天换液，后期每3天全换液一次，待细胞培养至融合度90％以上后传代，传代至P1代时，流式检测CD106表达率，CD106表达高于30％则继续培养，否则丢弃重新制备；
[0016]还包括步骤三，传代后继续培养，CD106将持续增长，P4～P6代时CD106表达将达到85％以上，收获细胞前24h加入干扰素
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γ及肿瘤坏死因子
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α。
[0017]有益效果，本申请的技术方案具备如下技术效果：本专利技术从胎盘组织中提取绒毛膜层细胞，CD106初始表达较高，CD106更容易高表达，研发的无血清定向培养基，使每批次细胞增殖及CD106表达稳定，减少CD106表达的波动性，使临床使用成为可能。在使用前24h加入TNF
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α进一步促进CD106表达，并在24h内使用IFN
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γ对细胞进行刺激，固定CD0106阳性细胞的抑炎状态，使其在体内不会变为促炎状态。
附图说明
[0018]图1为本专利技术样本乙，在P4代细胞CD106表达率图。
[0019]图2为本专利技术样本020
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B，在P4代细胞CD106表达率图。
[0020]图3为本专利技术样本020
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B
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γ+α，在P6代细胞CD106表达率图。
具体实施方式
[0021]为了更了解本专利技术的
技术实现思路
，特举具体实施例说明如下，本公开的实施例不必包括本专利技术的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本专利技术所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本专利技术公开的一些方面可以单独使用，或者与本专利技术公开的其他方面的任何适当组合来使用。
[0022]本实施例提供一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的方法，方案如下，选取胎盘绒毛膜干细胞作为培养CD106阳性细胞的初始细胞。相较于脐带间充质干细胞，胎盘绒毛膜干细胞起始CD106表达率约10～20％，而脐带间充质干细胞基本＜5％。因此绒毛
膜干细胞更容易转化为CD106高表达细胞，避免了因子的过度刺激及改造导致干细胞不可预知性。同时也使CD106表达率更高。本实施例选取的细胞解决了目前技术中因子刺激较大，CD106表达波动性大以及CD106表达不够高的问题。
[0023]再通过配置促进CD106高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基，其特征在于：包含90～95％的DMEM/12、5
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10％血清替代物，并添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、地塞米松和白介素10(IL10)。2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基，其特征在于：所述地塞米松的用量为10^
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10～10^
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11mol/L，EGF的用量为10～40ng/ml，bFGF的用量为5～15ng/ml，IL10的用量为20～60ng/ml。3.一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：选取胎盘绒毛膜干细胞作为培养CD106阳性细胞的初始细胞；步骤二：通过配置如权利要求1所述的一种促进间充质干细胞稳定表达CD106阳性细胞的培养基，将胎盘绒毛膜干细胞置于上述培养基进行表达培养，在培养过程中使得胎盘绒毛膜干细胞始终处于CD106表达的状态，并使得胎盘绒毛膜干细胞CD106表达比例持续增加，最终达到CD
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106表达高于85％的状态。4.根据权利要求3所述的一种促进CD106阳性细胞稳定表达的培养方法，其特征在于：步骤一的具体操作为：取新鲜...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建波，刘韬，王长亮，李利利，翁平，
申请(专利权)人：江苏育瑞康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：