诱导血管生成的间充质干细胞支架及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，该间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。该间充质干细胞支架能够很好地促进血管生成与延长，可应用于心脏及肢体缺血缺氧部位诱导血管生成，具有改善微循环和供血供氧、缓解和治疗缺血缺氧性疾病的前景。缓解和治疗缺血缺氧性疾病的前景。缓解和治疗缺血缺氧性疾病的前景。

【技术实现步骤摘要】
诱导血管生成的间充质干细胞支架及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种诱导血管生成的间充质干细胞支架及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]目前，机体局部血管痉挛或堵塞造成的血流降低或中断，常导致该区域的组织细胞因缺氧和营养物质供给不足而坏死，持续的细胞死亡导致炎症和纤维增生，由此引发的心脑血管疾病和肢体缺血性疾病在临床上具有很高的致死率、致残率。传统的治疗方法多以疏通血管为主，但血管再灌注造成的损伤也不容忽视。近年来，在缺血部位诱导血管新生成为一种新的治疗手段。血管生成与成熟是一个多因子高度时序性调控的过程。新血管的生成由VEGF、bFGF等促血管生成因子起始，招募平滑肌细胞和外周细胞pericytes，随后PDGF促进新生血管的成熟(Lu
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s Henrique Wolff Gowdak and Jos
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Eduardo Krieger，2018)。在缺血部位引入血管生成诱导因子VEGF、bFGF、PDGF等，可诱导原有血管的内皮细胞增殖、迁移形成新的血管。因此，将促进血管生成与成熟的因子高效、便捷地导入缺血部位是改善和治疗缺血性疾病的关键。
[0003]目前研究中，大多利用PLGA[poly(lactic
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co
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glycolic acid)](Mohandas et al.,2015)、PLLA[poly(L
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lactic acid)]和fibrin(Golub et al.,2010)、丝素蛋白(Wang et al.,2017)、热休克蛋白(Takagishi et al.,2021)等生物大分子材料包被VEGF、PDGF等细胞因子制成纳米颗粒(nanoparticles，NPs)，再将纳米颗粒装载于纤维素、甲壳素
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透明质酸、水凝胶等支架材料中进行移植，实现因子的原位递送和缓释、控释，达到诱导血管生成的作用。利用细菌纤维素/明胶海绵VEGF的装载效率为66.5％，2d内91％以上的VEGF都被释放；将VEGF先用丝素蛋白制成纳米颗粒、再结合细菌纤维素/明胶海绵几乎可装载全部的因子，因子的突释现象得到显著改善，第1d仅9.9％的VEGF释放，28d的累积释放率为51.4％(Wang et al.,2017)。静电纺丝法制备的核
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壳支架(polycaprolactone&1％PEG)装载VEGF，18h内累积释放38％，随后达到平台期，缓慢释放(Zigdon
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Giladi et al.,2017)。针对不同种类的细胞因子可根据需要分别制备NPs，其中核
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壳(core
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shell)2层结构的NPs可实现细胞因子的延迟释放。如，PLGA单层NPs包埋VEGF、bFGF，PLGA
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PLLA核
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壳2层结构的NPs包埋PDGF，可实现VEGF、bFGF先释放而PDGF延迟释放，有效促进血管生成与成熟(Izadifar et al.,2016)。然而，纳米颗粒的制备步骤多、工艺复杂，往往需要一些特殊的仪器设备，如超声波材料乳化分散器、超速冷冻离心机、冷冻干燥仪等，涉及多种细胞因子的NPs制备与工艺控制更为复杂；另外，细胞因子、包埋材料如PLGA等价格昂贵、包埋效率有限，药物制备成本高，大大限制了其推广应用。
[0004]除了用细胞因子诱导缺血部位生成新的血管，干细胞移植，再由干细胞分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞从而形成新的血管，提供了一种新的治疗手段。胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞等，都具有分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞、形成新血管的潜能，其中间充质干细胞因来源广泛、易于分离获得、增殖和分化能力强、免疫原性低且具
有很强的免疫调节、减轻纤维化等作用，成为临床上备受关注和认可的移植细胞来源之一。
[0005]间充质干细胞不仅具有分化形成新血管的潜能，而且具有强大的旁分泌能力，可分泌水溶性细胞因子(如血管内皮细胞生长因子VEGF、血小板衍生生长因子PDGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、肝细胞生长因子HGF、胰岛素样生长因子IGF
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1等)、microRNAs和外泌体exosomes等，这些物质被认为是间充质干细胞移植后发挥治疗作用的重要成分，其中VEGF、bFGF、PDGF、HGF等可溶性细胞因子具有诱导血管生成与成熟的作用。间充质干细胞(MSCs)的分泌物还具有调节免疫反应、减轻纤维化的作用，有助于改善微环境、进一步促进新生血管网络的形成与生长。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术提供了一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，该间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。
[0007]进一步地，该间充质干细胞选自以下的一种或多种：骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、羊水间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、睾丸间充质干细胞、皮肤间充质干细胞和胎盘间充质干细胞。
[0008]进一步地，该间充质干细胞为自体来源的间充质干细胞和/或异体来源的间充质干细胞。
[0009]进一步地，该自体来源为自体外周血和/或脂肪来源。
[0010]进一步地，该异体来源为异体脐带华通氏胶、脐带血、羊水和/或胎盘来源。
[0011]进一步地，该间充质干细胞分泌选自以下的一种或多种物质：可溶性细胞因子、微小核糖核酸和外泌体。
[0012]进一步地，该可溶性细胞因子选自以下的一种或多种：血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞源性因子和胰岛素样生长因子。
[0013]进一步地，该支架材料是可降解生物材料。
[0014]进一步地，该支架材料是部分降解的、改性的化合物例如温敏性化合物和/或光敏性化合物。
[0015]进一步地，该支架材料选自以下的一种或多种：可降解的蛋白质或多肽类材料、可降解的多糖类材料、聚酯类水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶例如聚(N
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异丙基丙烯酰胺)水凝胶、聚丙烯酸水凝胶和聚乙烯醇水凝胶。
[0016]进一步地，该可降解的蛋白质或多肽类材料选自以下的一种或多种：胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、丝素蛋白、改性的明胶水凝胶例如甲基丙烯酰化明胶、改性的丝素蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化丝素蛋白和改性的弹性蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化弹性蛋白。
[0017]进一步地，该可降解的多糖类材料选自以下的一种或多种：纤维素、甲壳素、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、改性的光敏性甲壳素例如甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖、改性的褐藻酸盐水凝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，其特征在于，所述间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是由所述支架的外周向所述支架的中央逐渐增高分布的，或者由所述支架的一端向所述支架的另一端逐渐增高分布的。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞支架，其特征在于，所述间充质干细胞选自以下的一种或多种：骨髓间充质干细胞、外周血充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、羊水间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、睾丸间充质干细胞、皮肤间充质干细胞和胎盘间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为自体来源的间充质干细胞和/或异体来源的间充质干细胞；优选地，所述自体来源为自体外周血和/或脂肪来源；优选地，所述异体来源为异体脐带华通氏胶、脐带血、羊水和/或胎盘来源；更优选地，所述间充质干细胞分泌选自以下的一种或多种物质：可溶性细胞因子、微小核糖核酸和外泌体；又优选地，所述可溶性细胞因子选自以下的一种或多种：血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞源性因子和胰岛素样生长因子。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞支架，其特征在于，所述支架材料是可降解生物材料；优选地，所述支架材料是部分降解的、改性的化合物例如温敏性化合物和/或光敏性化合物；优选地，所述支架材料选自以下的一种或多种：可降解的蛋白质或多肽类材料、可降解的多糖类材料、聚酯类水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶例如聚(N
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异丙基丙烯酰胺)水凝胶、聚丙烯酸水凝胶和聚乙烯醇水凝胶；又优选地，所述可降解的蛋白质或多肽类材料选自以下的一种或多种：胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、丝素蛋白、改性的明胶水凝胶例如甲基丙烯酰化明胶、改性的丝素蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化丝素蛋白和改性的弹性蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化弹性蛋白；又优选地，所述可降解的多糖类材料选自以下的一种或多种：纤维素、甲壳素、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、改性的光敏性甲壳素例如甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖、改性的褐藻酸盐水凝胶例如甲基丙烯酰化藻酸盐、改性的透明质酸水凝胶例如甲基丙烯酰化透明质酸、改性的硫酸软骨素水凝胶例如甲基丙烯酰化硫酸软骨素和细菌纤维素水凝胶；更优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为30％～90％例如约30％、约60％或约90％；尤其优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～20％；特别优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～10％例如约5％、约8％或约10％。4.一种制备权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞重悬于水凝胶中，形成细胞悬液；以及(2)将所述细胞悬液通过3D打印形成所述间充质干细胞支架，或者将所述细胞悬液通过铺展于培养皿/模具中并进行交联形成所述间充质干细胞支架，其中所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是由所述支架的外周向所述支架的中央逐渐增高分布的，或者由所述支架的一端向所述支架的另一端逐渐增高分布的。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述细胞悬液的细胞密度为(0.01～10)
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105个/ml。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞支架的形状为适用于损伤区域的形状；优选地，所述形状为方形、圆形或椭圆形；优选地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约5～20mm
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约5～20mm，高约1～3mm的间充质干细胞支架或者上底约3～15mm
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【专利技术属性】
技术研发人员：贺丽虹，成舒婷，赵凯峰，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：