一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法技术

技术编号:33703326 阅读:19 留言:0更新日期:2022-06-06 08:20
本发明专利技术公开了一类高通量蛋白质组定量试剂(IBT

【技术实现步骤摘要】
一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法


[0001]本专利技术属于化学合成
,具体涉及一类高通量蛋白质组定量试剂 的固相合成方法。

技术介绍

[0002]近年来,蛋白质组学在蛋白质识别和定量技术上有着巨大的进展,对于 我们深入理解细胞中蛋白质的表达、翻译后修饰、不同蛋白质之间的相互作 用,以及探索其对应的生物学功能方面起着重要作用。生物质谱技术是最为 广泛使用的蛋白质组学研究工具,具有一次能够精确分析上万个蛋白质的特 点。但是,因为质谱信号容易受到各种因素的干扰,包括仪器设备的电信号噪 声,生物样品中的干扰分子与基质效应等,采用质谱技术对蛋白组学进行定 量分析需要专门的样品和数据处理方法,主要分为非标法(label free methods) 和稳定同位素标记法(labeledmethods)两大类。非标法主要是通过算法比较 在不同液相串联(LC

MS/MS)质谱分析试验中多肽信号强度,保留时间等参 数来对蛋白质进行定量分析。稳定同位素标记法是首先对不同样品的多肽进 行标记,然后混合在一起进行LC

MS/MS分析。由于稳定同位素标记试剂的 化学结构完全一致,仅在采用的稳定同位素种类和位置上有所不同,因此, 全部样品在一次LC

MS/MS分析中完成,这样可以最大限度地减少不同的样 本在不同此测量中产生的差异,对仪器设备重现性的要求低,降低了在非标 法中无法避免的重复性问题。同时,因为多个样品可以在一次LC

MS/MS中 分析,可以大大节省大队列体样品的分析时间。
[0003]根据定量的不同原理,稳定同位素标记法又可以分为两大类。第一类是 基于一级质谱(MS1)定量。SILAC(Stable isotope labeling with amino acids incell culture)是一种基于MS1定量的代表方法。这是通过在细胞培养基中分 别加入普通氨基酸和含有稳定同位素标记的氨基酸实现的。在不同条件中生 长的细胞混合在一起后,经过正常的蛋白质组学样品处理后,不同来源的蛋 白在MS1上显示一定的质量差异,其对应的峰面积代表了在原始样品中的相 对含量。第二类是基于二级质谱(MS2)定量。其中同量异位标记法(IsobaricLabeling)是基于MS2的代表分析方法,包括iTRAQ(isobaric tag for relativeand absolute quantification),TMT(tandem mass tag)以及IBT(isobaric tag)等。 与SILAC等基于一级质谱的定量方法相比,同量异位标记后的多个样品混合 后,在MS1上不会显示质量差异。因此,不同样品中所含的同一多肽合并产生 一个分子峰,相当于增强了样品浓度,使检测的灵敏度大大提高。同时并未 增加MS1图谱的复杂度,更加适用于多个样品的比较分析。同时,SILAC标 记的定量方法依赖于细胞摄入含稳定同位素的精氨酸或赖氨素合成蛋白,进 而再分析这些含有标记氨基酸的蛋白质。这种方法只在可以培养的细胞中容 易实现,但在动物组织,人体样品的分析中难以应用。而同量异位标记法则 不受样本来源的限制,可以广泛应用于各种临床样品。
[0004]目前,市场上已经有多种同量异位标签试剂,包括iTRAQ

4PLEX(最多 同时鉴定4个蛋白组样品),iTRAQ

8PLEX(最多同时鉴定8个蛋白组样品), TMT

10PLEX(最多同时鉴定
10个蛋白组样品),IBT

10PLEX(最多同时鉴 定10个蛋白组样品),TMTpro

16PLEX(最多同时鉴定16个蛋白组样品) 等。我们也开发了IBT

16PLEX(最多同时鉴定16个蛋白组样品)。每组 IBT

16PLEX是由16个化学结构和分子量一致,但在不同位置含有13C或者 15N的化学分子。其结构包括了三部分:报告基团

平衡基团

活化基团。具体 结构如下:
[0005][0006]其中,活化基团通过与多肽侧链官能团的特异性反应(N

端氨基,赖氨酸 的氨基,半胱氨酸的巯基,酪氨酸的羟基等)对多肽进行标记。报告基团与平 衡基团的总质量是一致的。但是,报告基团和平衡基团通过一个MS/MS可剪 切键连接,这样,在二级质谱中,IBT

16PLEX标记的样品会产生一组特征性 报告离子,其相对峰高用于测定原样品中的相对含量。
[0007]IBT

16PLEX试剂的合成是通过一个11步的液相合成法完成的(中国专利技术 专利申请202011518641.8)。每套试剂的合成需要16
×
11=176个反应。同时在 每个反应中,需要进行分离纯化步骤,因此需要消耗大量的时间和溶剂。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法, 以解决上述
技术介绍
中提出的问题,从而能够提高合成的效率,降低合成的 成本。
[0009]本专利技术的合成路线如下:
[0010][0011]通过上述固相合成法,选用不同的含有稳定同位素的原料,可以很方便 的合成IBT

16PLEX试剂。为了保证每步反应的完成,通常过量(2倍相对于 固相树脂上的官能团摩尔量)的稳定同位素Fmoc

beta

Ala

OH或者 Fmoc

Gly

OH加入到反应混合液中,未反应的Fmoc

beta

Ala

OH和 Fmoc

Gly

OH可以通过制备液相色谱纯化回收使用,从而降低了合成成本。
[0012]下表中为不同标签对应的不同原料:
[0013][0014][0015]为实现上述目的,本专利技术提供如下技术方案:一类高通量蛋白质组定量 试剂的固
相合成方法,按照先后顺序包括以下步骤:
[0016]第1步:Fmoc保护的氨基酸在脱水偶和剂DIC(diisopropylcarbodiimide, CAS No.693

13

0),添加剂HOBt(1

hydroxybenzotriazole,CAS No.123333

53
‑ꢀ
9),催化剂DMAP(4

Dimethylaminopyridine,CAS No.1122

58

3)作用下,偶 和到固相树脂Wang Resin中;
[0017]第2步:采用哌啶(piperidine,CAS No.110
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法,其特征在于:按照先后顺序包括以下步骤:第1步:Fmoc保护的氨基酸在脱水偶和剂、添加剂、催化剂作用下,偶和到固相树脂中;第2步:采用哌啶脱去Fmoc保护基团,得到一级胺基;第3步:Fmoc保护的氨基酸

1在脱水偶和剂、添加剂、碱性条件下,偶和到第2步中产生的一级胺基基团上;第4步:采用哌啶脱去上述步骤中的Fmoc保护基团,得到一级胺基;第5步:Fmoc保护的氨基酸

2在脱水偶和剂、添加剂、碱性条件下,偶和到第4步中产生的一级胺基基团上;第6步:采用哌啶脱去上述步骤中Fmoc保护基团,得到一级胺基;第7步:丙酮在还原剂作用下,进行还原胺化反应,加到第6步中产生的一级胺基上,然后,具有醛基的分子在还原剂作用下,进行第二个还原胺化反应,形成一个三级胺;第8步:采用4N的HCl/Dioxane溶液,将上述步骤中化合物IBT

16PLEX

OH从固相树脂上切除;第9步:将IBT

16PLEX

OH在碱性条件下,用TSTU活化得到活化琥珀酸酯IBT

16PLEX

NHS。2.根据权利要求1所述的一类高通量蛋白质组定量试剂的...

【专利技术属性】
技术研发人员:李舒伟
申请(专利权)人:南京谱利健生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:

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