一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂制造技术

本发明专利技术公开了一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂，其结构包含下式：报告基团

【技术实现步骤摘要】
一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂


[0001]本专利技术涉及生物分子分析试剂领域，特别是用于蛋白质组学的定量分析，具体为一类可同时对16个样品的蛋白质组学进行定量的同量异位标记试剂(IBT
‑
16PLEX)的制备和应用。

技术介绍

[0002]近年来，蛋白质组学领域在不断发展，特别是在蛋白质识别和定量分析方面。这一进展将有助于深入理解细胞中特定蛋白质的存在与其生物学功能之间的相互关系。由于高通量和高特异性的特点，生物质谱技术是最为广泛使用的蛋白质组学研究工具。但是，由于质谱信号受到仪器设备，干扰物，基质效应等多个因素的影响，采用质谱技术对蛋白组学进行定量分析需要专门的样品和数据处理方法，主要包括非标法(label free methods)和稳定同位素标记法(labeled methods)。与非标法相比，稳定同位素标记法具有众多优势。由于稳定同位素试剂标记的不同样品在液相串联(LC
‑
MS/MS)质谱分析之前被预先混合，使得全部样品在一次LC
‑
MS/MS分析中完成，有效的降低了不同样品在不同LC
‑
MS/MS中的系统误差，对仪器的重现性要求低，这样可以最大限度地减少不同的样本在不同此测量中产生的差异，解决在非标法中无法避免的重复性问题。同时，因为多个样品可以一次性完成定性定量分析，可以大大降低大队列体样品的分析时间。
[0003]稳定同位素标记法又分为基于一级质谱(MS1)定量和二级质谱(MS2)定量的方法。例如，SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)是一种基于 MS1的蛋白质标记方法，是在细胞培养基中加入含有稳定同位素标记的氨基酸实现的。同量异位标记法(Isobaric Labeling)是属于基于MS2的分析方法，包括iTRAQ(isobaric tagfor relative and absolute quantification),TMT(tandem mass tag)以及IBT(isobarictag)。
[0004]与SILAC等基于一级质谱的定量方法相比，同量异位标记后的多个样品混合后，不同样品中所含的同一多肽被合并到一起，相当于增强了样品浓度，对应的MS/MS碎片信号变得更强，使检测的灵敏度大大提高。同时减少了质谱信号的复杂度，更加适用于多个样品的比较分析。另外，SILAC标记的定量方法依赖于细胞摄入含稳定同位素的精氨酸或赖氨素合成蛋白，进而再含有这些含有标记氨基酸的蛋白质。这种方法只在培养的细胞中可以实现，但在动物组织，人体样品的分析中难以应用。同量异位标记法则不受样本来源的限制，可以广泛应用于各种临床样品。
[0005]目前，市场上已经有多种同量异位标记试剂，包括iTRAQ
‑
4PLEX,iTRAQ
‑
8PLEX, TMT
‑
10PLEX,IBT
‑
10PLEX等。最近，Thermo公司推出了能够同时标记16个样品的 TMTpro
‑
16PLEX试剂盒。但是，TMTpro
‑
16PLEX不但价格昂贵，其鉴定蛋白也远少于TMT
‑
10PLEX 和IBT
‑
10PLEX，极大的限制了其在定量蛋白质组学上的应用。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术公开了一种可以同时对16个样品进行定量分析的同量异位标记技术(IBT
‑
16PLEX),包括了IBT
‑
16PLEX标记试剂的化学结构，稳定同位素在标记试剂中的位置，标记试剂的合成路线，以及标记试剂在蛋白质组学中的具体应用。
[0007]本专利技术提供了如下技术方案：
[0008]一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂，命名为IBT
‑
16PLEX试剂。IBT
‑
16PLEX 试剂包括了一组16个化学结构和分子量完全一致，但是在不同位置含有不同的稳定同位素的标记试剂。其结构包括了三部分：报告基团
‑
平衡基团
‑
活化基团。其中，活化基团通过与多肽含有的官能团的特异性反应(N
‑
端氨基，赖氨酸的氨基，半胱氨酸的巯基等)对多肽进行标记。报告基团与平衡基团的总分子量是一致的。但是，报告基团和平衡基团通过一个MS/MS 可剪切键连接，这样，在二级质谱中，IBT
‑
16PLEX标记的样品会产生一组特征性报告离子，其相对峰高用于测定原样品中的相对含量。
[0009]本专利技术公开了两组不同的IBT
‑
16PLEX试剂的化学结构(结构A和结构B)。每组结构有细微差别，在具体应用中可以互换。
[0010]IBT
‑
16PLEX试剂(结构A)标记多肽的反应以及标记后的多肽在串联质谱中裂解形成的报告基团的结构如下。
[0011][0012]一组IBT
‑
16PLEX试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂。在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素，因此报告基团的质量是不同的，但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。这样，每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。报告基团和平衡基团通过可剪切键连接，剪切键在MS/MS中优先断裂，产生一系列报告基团离子，分别具有不同的分子式和质量，其报告基团和平衡基团离子的具体分子式和精确质量如下：
[0013]标记代码报告基团分子式报告基团分子量平衡基团分子式平衡基团分子量总分子量T114C7H
16
N
+
114.1277
13
C7H
1115
NO
2+
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N
+
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C7H
11
NO
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N
+
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+
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C6H
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NO
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N
+
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C5H
1115
NO
2+
147.0922263.2266T117NC
51本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂，其特征在于：所述试剂包括了一组16个化学结构和分子量完全一致，在不同位置含有不同的稳定同位素的标记试剂，其结构包括了三部分：报告基团
‑
平衡基团
‑
活化基团；其中，活化基团通过与多肽含有的不同官能团的特异性反应对多肽进行标记；报告基团与平衡基团的总质量是一致的，报告基团和平衡基团通过一个MS/MS可剪切键连接。2.如权利要求1所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂，其特征在于：所述试剂的结构具体为：一组试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂；命名为：T114,T115N,T115C,T116N,T116C,T117N,T117C,T118N,T118C,T119N,T119C,T120N,T120C,T121N,T121C,T122；在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素，保持报告基团和平衡基团的总分子量一致；标记试剂在二级质谱中通过剪切键的位置产生报告基团；一组试剂的报告基团的质量在114至122Da的范围内，可以独立地选自13C和/或15N的不同数目和位置的同位素原子组合；具体结构式如下：具体结构式如下：
。3.如权利要求2所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂，其特征在于：所述试剂的结构具体为：其报告基团和平衡基团离子对应的化学结构如下，其中星号标记代表一组试剂中稳定同位素15N和13C的位置；。4.如权利要求1所述的一类基于二级质谱定量的高通量蛋白质组标记试剂，其特征在于：所述试剂的结构具体为：一组试剂包括了16个化学结构完全相同的标记试剂；命名为：T114,T115N,T115C,T116N,T116C,T117N,T117C,T118N,T118C,T119N,T119C,T120N,T120C,T121N,T121C,T122；在每个标记试剂中的不同位置含有13C或15N同位素，保持报告基团和平衡基团的总分子量一致；标记试剂在二级质谱中通过剪切键的位置产生报告基团；一组试剂的报告基团的质量在114至122Da的范围内，可以独立地选自13C和/或15N的不同数目和位置的同位素原子组合；具体结构式如下：
标记代码报告基团分子式报告基团分子量平衡基团分子式平衡基团分子量总分子量T114C7H
16
N
+
114.1277
13
C6H8N
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N2O
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C6H8N
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NO
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【专利技术属性】
技术研发人员：李舒伟，
申请(专利权)人：南京谱利健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：