一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于固相法分离N‑糖肽和O‑糖肽的方法，首先通过还原胺化反应将糖蛋白偶联到固相树脂上，然后对糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗，再加入蛋白消化酶对固定在树脂上的糖蛋白进行降解处理。产生的糖肽用亲水色谱柱富集。然后通过表面修饰凝集素的固相柱，将O‑糖肽保留在凝集素固相柱上，而N‑糖肽包含在过滤液中。采用O‑糖肽切割酶(OpeRATOR)，将结合在凝集素上的O‑糖肽切割洗脱；或采用多肽变性方法将O‑糖肽洗脱。这样就将N‑糖肽和O‑糖肽分别进行了富集分离，本方法对研究各种病毒的致病机制，包括新型冠状病毒COVID‑19，禽流感、寨卡病毒(Zika virus)和登革病毒(Denge virus)，开发疫苗等方面有着重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法
本专利技术涉及生物分子分析试剂
，具体涉及一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法。
技术介绍
：蛋白质糖基化的分析通常包括多糖的组成和结构、糖基化位点和糖肽序列分析。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)和液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-ESI)是蛋白质糖基化研究的主要分析方法。蛋白质糖基化分为N-糖基化和O-糖基化两种。N-糖基化发生在N-X-S/T(X＝除脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸以外的任何氨基酸)序列中的天冬酰胺(N)上。N-多糖可以用糖苷水解酶(例如PNGaseA和PNGaseF)从蛋白上切割下来进行进一步的研究。O-糖基化发生在没有特定序列规则的丝氨酸和苏氨酸上。自然界尚未发现一种通用的糖苷水解酶可以将O-多糖从蛋白上切割下来。因此，O-多糖一般是用碱性化学方法处理，将之从蛋白上解离出来。在这种情况下，会产生过多的副反应，严重影响对O-多糖的组成和结构的分析。但是，最近发现了一些内切蛋白酶，可以识别O-多糖位点，并在O-多糖位点切割糖肽，有助于O-糖基化分析、O-多糖谱解析、O-聚糖位点测定等。例如，OpeRATOR(O-糖肽切割酶)是一种内切蛋白酶，该酶源自黏液阿克曼(Akkermansiamuciniphila)，并在大肠杆菌中表达。该酶含有His标签，分子量为42kDa。可催化天然黏蛋白型O-糖基化蛋白中与O-聚糖直接相邻的肽键的水解。OpeRATOR高度特异性地在丝氨酸或苏氨酸的O-多糖N端消化蛋白质，但是不会对带有N-多糖的天冬酰胺消化。同时，在对该酶的活性位点进行变异后，能够保留识别O-多糖位点的亲和力，但是失去了对O-糖肽进行切割的能力。(Yang,S.；Onigman,P.；Wu,W.W.；Sjogren,J.；Nyhlen,H.；Shen,R.-F.；Cipollo,J.Anal.Chem.2018,90,8261-8269)。本专利技术利用了变异后的OpeRATOR的这种能力，实现了O-糖肽的特异性富集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，以解决现有技术中将O-糖肽从蛋白上解离出来时会产生副反应的缺陷。一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，所述方法包括如下步骤：将糖蛋白偶联到固相树脂上；通过衍生化试剂对固相在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗，加入胰蛋白酶降解处理后，得到多肽混合物；将获得的多肽溶解后，对N-糖肽和O-糖肽进行分离。进一步的，将糖蛋白偶联到固相树脂上的方法包括如下步骤：将糖蛋白溶解在0.3～2.0mL的缓冲液A中，加入醛基树脂并在室温下混合2-6小时；添加10-30μl1MNaCNBH3后继续混合2-6小时；用300-600μl缓冲液B冲洗两次并进行烷基化处理。进一步的，所述烷基化处理的方法包括如下步骤：用含有5～15mMDTT，2-10M尿素，0.5-2M碳酸氢铵的溶液进行还原处理；加入10～20mM的碘乙酰胺并在20～50℃和避光环境中振荡0.5～2.0个小时。进一步的，通过衍生化试剂对固定在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗，其具体步骤为：用200～300mM1-羟基苯并三唑水合物和200～300mMEDC.HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐)的乙醇溶液，在37℃恒温与固定在树脂上的糖蛋白唾液酸反应1小时；分别用100％乙醇，1MNaCl和HPLC纯净水将样品洗涤三次。进一步的，在对固定在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗后，加入胰蛋白酶降解处理后去除溶剂，得到多肽的方法包括如下步骤：用1M氯化钠，10％乙腈溶液冲洗后，加入胰蛋白酶在碱性环境下通过100mM碳酸氢铵和1M尿素溶液的降解固相化的糖蛋白；收集产生的多肽后，采用亲水色谱柱对糖肽(N-糖肽和O-糖肽的混合物)进行富集并用乙腈的水溶液(40％乙腈，60％水)清洗；用离心干燥仪除去溶剂得到多肽。进一步的，将获得的多肽溶解后，对N-糖肽和O-糖肽进行分离的方法包括如下步骤：将多肽溶解在300-500μl缓冲液C中与树脂混合后振荡1小时，然后在600～1200rpm离心1-5min，收集上层清液；用300-800μl的缓冲液B中对树脂进行了二次重洗；将洗脱液汇集，并用反相C18纯化，用离心干燥仪除去溶剂并重新溶解在50μl的0.2％甲酸溶液中，获得N-糖肽；分别用1MNaCl500μl、10％乙腈溶液500μl和纯水500μl对树脂进行洗涤；将400-500μl含有100单位的O-糖肽切割酶的20mMNH4HCO3溶液和树脂混合后在37℃振荡8-15小时后，离心取上层清液；用200-400μl10％乙腈溶液清洗2-4次，并洗脱液收集在一起；用离心干燥仪除去洗脱液中的溶剂，重新溶解在0.2％的甲酸溶液，获得O-糖肽。进一步的，所述缓冲液A包括10mM柠檬酸钠，50mM碳酸钠，其pH＝10；所述缓冲液B包括50mM的PBS，其pH＝7.4；所述缓冲液C包括50mM的NH4HCO3溶液，其pH＝8.0。进一步的，所述固相树脂为亲水性固体材料，包括硅胶、琼脂糖和表面包被亲水性基团的磁珠中的一种或多种组合。本专利技术的优点在于：该种基于固相纯化的方法可以采用过量衍生试剂的方法实现100％的唾液酸衍生化，降低常见的副反应，从而高效分离N-糖肽和O-糖肽，减少不含糖基修饰的多肽背景污染，有助于精确识别N-糖基化和O-糖基化位点，在下列各种场景(但不仅限于这些场景)有广泛应用：(1)在蛋白药物的研发与生产过程中，用于分析多糖来提高蛋白药物的疗效以及质量控制；(2)对各种涉及糖基化异常的复杂疾病(包括癌症，老年痴呆症等)进行研究并识别各种疾病的特征生物标记物；(3)对各种病毒(包括冠状病毒，寨卡病毒和登革热病毒等)进行研究并开发疫苗。附图说明图1为本专利技术中方法的工作流程示意图。图2为本专利技术中血型糖蛋白A(GPA)的糖基化分析示意图。图3为本专利技术中A型流感病毒H1N1神经氨酸酶野生型和N295S突变型O-糖基化的比较示意图。具体实施方式为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。如图1至图所示，一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一：将糖蛋白偶联到固相树脂上：将糖蛋白溶解在0.3～2.0mL的缓冲液A(10mM柠檬酸钠，50mM碳酸钠，pH＝10.0)中，加入醛基树脂并在室温下混合2-6小时；添加10-30μl1MNaCNBH3后继续混合2-6小时；用300-600μl缓冲液B(50mMPBS,pH＝7.4)冲洗两次并进行烷基化处理；其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n将糖蛋白偶联到固相树脂上；/n通过衍生化试剂对固相在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗，加入胰蛋白酶降解处理后，得到多肽混合物；/n将获得的多肽溶解后，对N-糖肽和O-糖肽进行分离。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将糖蛋白偶联到固相树脂上；
通过衍生化试剂对固相在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗，加入胰蛋白酶降解处理后，得到多肽混合物；
将获得的多肽溶解后，对N-糖肽和O-糖肽进行分离。


2.根据权利要求1所述的一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于：将糖蛋白偶联到固相树脂上的方法包括如下步骤：
将糖蛋白溶解在0.3～2.0mL的缓冲液A中，加入醛基树脂并在室温下混合2-6小时；
添加10-30μl1MNaCNBH3后继续混合2-6小时；
用300-600μl缓冲液B冲洗两次并进行烷基化处理。


3.根据权利要求2所述的一种基于固相法分离N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于：所述烷基化处理的方法包括如下步骤：
用含有5～15mMDTT，2-10M尿素，0.5-2M碳酸氢铵的溶液进行还原处理；
加入10～20mM的碘乙酰胺并在20～50℃和避光环境中振荡0.5～2.0个小时。


4.根据权利要求3所述的一种基于固相法分离N-多糖和O-糖肽的方法，其特征在于：通过衍生化试剂对固定在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗的具体步骤为：
采用200～300mM1-羟基苯并三唑水合物和200～300mMEDC.HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐的乙醇溶液，在37℃恒温下与固定在树脂上的糖蛋白唾液酸反应1小时，分别用100％乙醇，1MNaCl和HPLC纯净水将样品洗涤三次。


5.根据权利要求4所述的一种基于固相法分离N-多糖和O-糖肽的方法，其特征在于：在对固定在树脂上的糖蛋白唾液酸进行衍生化并清洗后，加入胰蛋白酶降解处理后去除溶剂，得到多肽的方法包括如下步骤：
用1M氯化钠，10％乙腈溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霜，李舒伟，
申请(专利权)人：南京谱利健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32