类胰蛋白酶活性测定用底物制造技术

本发明专利技术的课题是提供一种以简单的操作来准确迅速地测定血液样品中类胰蛋白酶活性的方法，以便准确地评估肥大细胞参与的疾病所处的疾病状况。根据本发明专利技术，通过类胰蛋白酶活性测定用底物可以直接测定血液样品中的类胰蛋白酶活性，无需对血液样品进行纯化、浓缩等预处理，所述类胰蛋白酶活性测定用底物包含选自下式(1)～(3)的C末端肽键合了染料标记物的三肽：(1)Lys

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】类胰蛋白酶活性测定用底物


[0001]本专利技术涉及类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，包含C末端肽键合了染料标记物的特定三肽，通过切割前述三肽的C末端肽键，前述染料标记物的荧光特性或发色特性变化；涉及使用该底物测定血液样品中的类胰蛋白酶活性的方法；且涉及包含该底物的血液样品中的类胰蛋白酶活性测定用试剂盒。

技术介绍

[0002]将过敏性疾病和肿瘤、早产儿视网膜病等特别是肥大细胞参与疾病状况的疾病诊断为肥大细胞活化综合征。在肥大细胞释放的各种介质中，作为蛋白分解酶的类胰蛋白酶由于其特异性而用于疾病状况评估中。当前，世界范围内使用利用特异性抗体的免疫反应(ELISA)进行其定量。但是，由于类胰蛋白酶作为酶发挥作用并影响生物体，因此对判断疾病状况而言测定其酶活性是重要的，而只能确定类胰蛋白酶相关蛋白作为抗原的存在量的ELISA是不充分的。
[0003]本专利技术人们报道了自肥大细胞释放的类胰蛋白酶对于早产儿视网膜病的发病是必不可少的(非专利文献1)。在该报告中，本专利技术人们已经使用ELISA确定了类胰蛋白酶的参与，但是如上所述，在考虑如何能够评估新生儿的疾病状况(是否失明、选择治疗方法)的情形，测定酶活性是必须的。
[0004]类胰蛋白酶是通过肥大细胞脱颗粒释放到血液中的一种酶，血液浓度通常低至约10μg/L左右的低浓度(非专利文献2、3。在非专利文献3中报道了直至1岁时健康幼儿血清中的存在量是4.67μg/L)。由于用现有的类胰蛋白酶底物不能检测到该浓度，因此有必要浓缩样品溶液或延长反应时间，结果是，目前难以进行准确、迅速的测定。另外，为了简单地测定类胰蛋白酶活性，期望提供样品制备容易的血清直接使用，但是血清中存在凝血酶(作为凝血系统中的一种蛋白酶)，在使用公知的蛋白酶底物进行类胰蛋白酶活性测定的情形，凝血酶显示出比类胰蛋白酶的活性极大的活性，会干扰测定。
[0005]自1980年代以来，在类胰蛋白酶的酶化学研究中，使用了Boc
‑
Phe
‑
Ser
‑
Arg
‑
MCA和Tos
‑
Gly
‑
Pro
‑
Arg
‑
MCA等，它们从那时起就作为胰蛋白酶的荧光底物市售。除了这些以外，还研究了几种三肽
‑
MCA的底物特异性，但是除了上述两种以外，通常不使用其他底物(非专利文献4～16)。由于类胰蛋白酶是胰蛋白酶样酶，只要是在C末端具有Arg的MCA底物，则可以灵敏度(可持续性)或高或低地检出酶活性，因此，对三肽的氨基酸序列目前还没有尝试进行最优化。
[0006]另外，近年来，据报道Ac
‑
Lys
‑
Pro
‑
Arg
‑
FMCA(7
‑
氨基
‑4‑
三氟甲基香豆素)是类胰蛋白酶的良好底物(非专利文献17)。该序列中Lys的存在为类胰蛋白酶对天然底物蛋白的作用位点提供了有价值的启示。此外，在20年前，通过在基板上构建三肽文库的方法，构建了研究蛋白酶的底物特异性的全面的文库，并明确了对β
‑
类胰蛋白酶I和II灵敏度最高的三肽序列是
‑
Lys/Arg
‑
Asn
‑
Lys/Arg
‑
(非专利文献18)。P2位Asn显示比P2位Ala灵敏度高2倍，进一步地，P3位在侧链带正电荷的氨基酸比P3位Ala灵敏度高约2倍左右。但是，遗憾的是，
2001年发表的该出色研究成果从未像
i
Boc
‑
Arg
‑
Asn
‑
Arg
‑
MCA这样的易于使用的形式实用化。
[0007]如上所述，到目前为止，已经报道了可以作为类胰蛋白酶底物的三肽，但是据专利技术人所知，还没有报道将该底物用于直接测定混杂有蛋白酶的血液样品，进一步地，由于该底物也可以被凝血酶等其他蛋白酶切割，因此，在合成能以混杂有蛋白酶的血液样品为直接测定对象的类胰蛋白酶活性测定用底物上，未能消除技术上的困难。
[0008]现有技术文献
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献1：J Clin Invest.,127(11),3987
‑
4000,2017.
[0011]非专利文献2：Thermo Fisher Scientific，Inc.,“用于诊断和预测的肥大细胞类胰蛋白酶(Mast cell Tryptase For diagnosis and prediction)”(http://www.phadia.com/Global/Market％20Companies/Finland/Mast％20Cell％20Tryptase％20for％20Diagnosis％20and％20Prediction.pdf)
[0012]非专利文献3：Allergy Asthma Proc.35,404
‑
408,2014.
[0013]非专利文献4：J.Biol.Chem.,258,13552
‑
13557,1983.
[0014]非专利文献5：J.Biol.Chem.,262,1363
‑
1373,1987.
[0015]非专利文献6：Biol.Chem.Hoppe
‑
Seyler,369,617
‑
625,1988.
[0016]非专利文献7：J.Biol.Chem.,263,18104
‑
18107,1988.
[0017]非专利文献8：Biol.Chem.Hoppe
‑
Seyler Suppl.,371,65
‑
73,1990.
[0018]非专利文献9：J.Biol.Chem.,267,13573
‑
13579,1992.
[0019]非专利文献10：J.Biochem.,120,856
‑
864,1996.
[0020]非专利文献11：Peptides,19,437
‑
443,1998.
[0021]非专利文献12：FEBS Lett.,408,85
‑
88,1997.
[0022]非专利文献13：British J.Pharm.,138,959
‑
967,2003.
[0023]非专利文献14：Allergology International,57,83
‑
91,2008.
[0024]非专利文献15：Chemical Science,6,1792
‑
1800,2015.
[0025]非专利文献16：IJC Metab本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.类胰蛋白酶活性测定用底物，其包含选自下式(1)～(3)的三肽
‑
X，所述三肽
‑
X是在C末端通过肽键键合了染料标记物的三肽：(1)Lys
‑
Ala
‑
Arg
‑
X(2)Ala
‑
Ala
‑
Arg
‑
X(3)Abu
‑
Ala
‑
Arg
‑
X式中，X是通过与Arg的肽键被切割而荧光特性或发色特性发生变化的染料标记物，Abu是2
‑
氨基丁酸。2.根据权利要求1所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，用于血液样品中的类胰蛋白酶活性的直接测定。3.根据权利要求1或2所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，将三肽
‑
X的N末端键合至分子量5,000以上的类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物。4.根据权利要求3所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物是聚氨基酸。5.根据权利要求4所述的类胰蛋白酶活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：松田浩珍，西野宪和，
申请(专利权)人：日商肽援有限公司，
类型：发明
国别省市：