蛋白纳米粒子的制备方法、所得蛋白纳米粒子及其应用技术

本发明专利技术公开了一种蛋白纳米粒子的制备方法，其包括如下步骤：将一种蛋白变性液进行离子交换层析，之后透析复性，即得；或者，将多种蛋白变性液分别进行离子交换层析，再混合，之后透析复性，即得；所述蛋白变性液中的蛋白为适用变复性方法的铁蛋白。本发明专利技术还公开了该方法制得的蛋白纳米粒子，以及该蛋白纳米粒子在制备疾病诊断或治疗的制剂中的应用。本发明专利技术的方法可消除复性过程中易出现的多聚沉淀现象，复性得率和纯度有显著提高，具有较高的标记物荷载能力。荷载能力。荷载能力。

【技术实现步骤摘要】
蛋白纳米粒子的制备方法、所得蛋白纳米粒子及其应用


[0001]本专利技术涉及一种蛋白纳米粒子的制备方法，以及该方法制得的蛋白纳米粒子及该蛋白纳米粒子的应用。

技术介绍

[0002]近年来，蛋白纳米粒子在疾病的诊断和治疗中，尤其是肿瘤的诊断和治疗方面，显示出了广阔的应用前景。通过精确地控制蛋白纳米粒子的大小、形状、组成、硬度、表面电荷和表面修饰配体，可以调节其体内循环时间、生物分布和肿瘤内部药物的分布等情况。例如，表面修饰了PEG的蛋白纳米粒子能有效躲避免疫系统的俘获，增强体内循环时间；表面修饰的配体可通过与肿瘤细胞过表达的受体等蛋白的特异性结合，使得诊断和治疗靶向肿瘤细胞(主动靶向)；减少蛋白纳米粒子的尺寸能促进其更深地进入肿瘤的内部；接近中性的表面电荷能尽可能减少血液中的调理蛋白纳米粒子的吸附，从而延长其循环时间。卓有成效的研究成果直接促使一些蛋白纳米粒子药物进入临床实验。以铁蛋白纳米粒子为例，因其具有良好的生物兼容性，可发展成纳米药物和诊断试剂，从而受到普遍关注。
[0003]目前，可以通过化学修饰和基因融合的策略实现蛋白纳米粒子的功能化。然而，现有的制备方法一方面大多只能采用低分子量的多肽进行表面修饰，另一方面大多采用对不同的蛋白分子进行分别功能化修饰，再通过调控溶液的pH解离，之后自主装这些不同的蛋白纳米粒子，制备过程中蛋白纳米粒子易形成沉淀或失活，使得功能化蛋白纳米粒子的得率通常不高。
[0004]本专利技术人之前的研究(专利ZL201010239499.3)公开了一种通过体外变复性策略制备功能化蛋白纳米粒子的方法。该方法可将分子量较大的蛋白修饰于蛋白纳米粒子表面，可避免pH调控方式引起的蛋白沉淀和失活的问题。然而，该方法在复性过程中仍然易出现多聚沉淀，所得复性产物的得率、纯度以及实际应用效果仍不理想，亟待进一步提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的变复性制备功能化蛋白纳米粒子的方法中复性过程易出现多聚沉淀、复性产物得率和纯度、以及实际应用效果不佳的缺陷，而提供一种新的蛋白纳米粒子的制备方法、及所得蛋白纳米粒子及其应用。本专利技术的方法可消除复性过程中的沉淀，复性产物得率和纯度显著提升、实际应用效果优异，而且易于实现工业化制备。
[0006]本专利技术通过下述技术方案解决上述技术问题：
[0007]本专利技术提供了一种蛋白纳米粒子的制备方法，其包括如下步骤：将一种蛋白变性液进行离子交换层析，之后透析复性，即得；或者，将多种蛋白变性液分别进行离子交换层析，再混合，之后透析复性，即得；所述蛋白变性液中的蛋白为适用变复性方法的铁蛋白。
[0008]本专利技术中，所述铁蛋白较佳地为融合铁蛋白，更佳地为天然蛋白修饰的铁蛋白或天然肽修饰的铁蛋白。
[0009]本专利技术中，所述蛋白变性液可按本领域常规蛋白变性方法制得，如将包涵体溶于含尿素的变性液中变性制得。所述含尿素的变性液较佳地含8M尿素，更佳地含8M尿素、1mM EDTA、10mM DTT和50mM Tris
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HC1，pH为7.9。所述变性的温度较佳地为26
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30℃，更佳地为28℃。所述变性的时间较佳地为10
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24h，更佳地为过夜。
[0010]本专利技术中，所述蛋白变性液中的蛋白可为重组蛋白。所述包涵体可按本领域常规方法，通过破碎表达菌体提取获得。所述表达菌体可按本领域常规方法，诱导表达工程菌表达蛋白后制得。
[0011]本专利技术一优选实例中，所述蛋白纳米粒子为EGF/HSA
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FTH1蛋白纳米粒子，所述蛋白变性液为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的EGF::FTH1蛋白的变性液，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HSA::FTH1蛋白的变性液。
[0012]其中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的EGF::FTH1蛋白可按ZL201010239502.1专利中记载的方法制备，具体为将人表皮生长因子EGF融合于铁蛋白重链亚基(FTH1)的N端，获得融合蛋白EGF::FTH1。EGF可与肿瘤细胞高表达的表皮生长因子受体EGFR受体结合，因此可将EGF作为靶向性分子来介导蛋白纳米粒子与细胞特异性的结合，用于高表达EGFR受体的肿瘤细胞的成像。
[0013]其中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HSA::FTH1蛋白可参照ZL201010239502.1专利中记载的方法制备，将HSA融合于FTH1的N端。HSA是人血清蛋白中富含较多赖氨酸残基且结构稳定的一段蛋白结构域。将HSA修饰于蛋白表面，一方面由于其高度的稳定性能较好地避免蛋白纳米粒子在体内的快速降解，另一方面为蛋白纳米粒子提供较多的
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NH2残基，为化学偶联小分子标记物或荧光成像分子提供位点，从而改善成像的灵敏度。
[0014]本专利技术中，所述离子交换层析可为阳离子交换层析或阴离子交换层析，优选阴离子交换层析。所述离子交换层析的具体操作条件可按本领域常规选择。
[0015]本专利技术一实例中，所述蛋白变性液为EGF::FTH1蛋白变性液和/或HSA::FTH1蛋白变性液。层析柱可采用阴离子交换类层析柱，较佳地采用DEAE阴离子交换层析柱。洗脱液可为含氯离子的缓冲液，较佳地为含NaCl的缓冲液，所述洗脱液的梯度浓度范围可为20mM至2M。洗脱液的pH可为5～14，较佳地为7。洗脱液最优选：含NaCl和8M尿素的pH为7.0的20mM Tris
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HCl缓冲液，所述NaCl的梯度浓度依次为20mM、50mM、100mM、200mM、400mM、1M和2M；收集含100mM NaCl的洗脱液。每个梯度的洗脱液的用量较佳地为8
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12个柱体积，更佳地为10个柱体积。
[0016]本专利技术中，所述层析后，当涉及多种蛋白变性液时，将层析后所得的各蛋白变性液按所需比例进行混合。例如，当制备所述EGF/HSA
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FTH1蛋白纳米粒子时，可按EGF::FTH1蛋白和HSA::FTH1蛋白的摩尔比大于或等于1，更佳地按6:4混合EGF::FTH1蛋白变性液和HSA::FTH1蛋白变性液。
[0017]本专利技术中，所述透析复性可按本领域常规进行。
[0018]本专利技术一优选实例中，所述蛋白纳米粒子为EGF/HSA
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FTH1蛋白纳米粒子，所述透析液为含有梯度浓度的尿素的透析液，具体如：透析液中含有50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris
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OH)、50mM NaCl、0.5mM EDTA、0.1wt％聚乙二醇(PEG)、10wt％甘油、0.2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，各步透析液还含有浓度依次为4M、3M、2M、0M的
尿素，pH 7.9。
[0019]透析复性后，可按常规进行后处理，如离心取上清液，超滤浓缩。
[0020]本专利技术还提供由本专利技术的方法制得的蛋白纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将一种蛋白变性液进行离子交换层析，之后透析复性，即得；或者，将多种蛋白变性液分别进行离子交换层析，再混合，之后透析复性，即得；所述蛋白变性液中的蛋白为适用变复性方法的铁蛋白。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述铁蛋白为融合铁蛋白，较佳地为天然蛋白修饰的铁蛋白或天然肽修饰的铁蛋白；和/或，所述铁蛋白为重组蛋白。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白变性液为EG F::FTH1蛋白变性液和/或HSA::FTH1蛋白变性液；较佳地为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的EGF::FTH1蛋白的变性液或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HSA::FTH1蛋白的变性液。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白变性液由包涵体溶于含尿素的变性液中变性制得，所述包涵体通过破碎表达菌体提取获得；所述表达菌体较佳地通过诱导表达工程菌表达蛋白后制得；所述含尿素的变性液较佳地含8M尿素，更佳地含8M尿素、1mM EDTA、10mM DTT和50mM Tris
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HCl，pH7.9；所述变性的温度较佳地为26
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30℃，更佳地为28℃；所述变性的时间较佳地为10
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24h，更佳地为过夜。5.如权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换层析为阳离子交换层析或阴离子交换层析，较佳地为DEAE阴离子交换层析柱。6.如权利要求5所述的制备方法，所述离子交换层析的洗脱液为含氯离子的缓冲液，较佳地为含NaCl的缓冲液，所述洗脱液的梯度浓度范围为20mM至2M；所述洗脱液的pH为5～14，较佳地为7；更佳地，所述洗脱液含NaCl和8M尿素的pH为7的20mM Tris
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HCl缓冲液；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹旭妮，邢天舟，李昕茹，曾伟民，杨云蛟，韩显洋，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：